မိုင်ယိုဆင် လေးလံသော ကွင်းဆက်ထက်ကျော်လွန်သော လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ မျိုးကွဲများ

nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ နောက်ဆုံးထွက် browser ဗားရှင်းကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ compatibility mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက် ဤဆိုက်တွင် style များနှင့် JavaScript များ ကင်းစင်မည်ဖြစ်သည်။
အရိုးစုကြွက်သားသည် myofibrils များဖြင့် အဓိကဖွဲ့စည်းထားသော ကွဲပြားသည့်တစ်ရှူးတစ်ခုဖြစ်ပြီး လူသားများတွင် ၎င်းကို အမျိုးအစားသုံးမျိုးခွဲခြားလေ့ရှိသည်- တစ်ခုမှာ "နှေးကွေးသော" (အမျိုးအစား ၁) နှင့် နှစ်ခုမှာ "မြန်ဆန်သော" (အမျိုးအစား 2A နှင့် 2X)။ သို့သော် ရိုးရာ myofibril အမျိုးအစားများအကြားနှင့် အတွင်း ကွဲပြားမှုကို ကောင်းစွာနားမလည်သေးပါ။ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသား vastus lateralis မှ တစ်ဦးချင်း myofibrils ၁၀၅၀ နှင့် ၁၀၃၈ ခုအတွက် transcriptomic နှင့် proteomic ချဉ်းကပ်မှုများကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ proteomic လေ့လာမှုတွင် အမျိုးသားများပါဝင်ပြီး transcriptomic လေ့လာမှုတွင် အမျိုးသား ၁၀ ဦးနှင့် အမျိုးသမီး ၂ ဦး ပါဝင်သည်။ myosin heavy chain isoforms များအပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် multidimensional intermyofibril ကွဲပြားမှု၏ရင်းမြစ်များအဖြစ် metabolic protein များ၊ ribosomal protein များနှင့် cellular junctional protein များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ နှေးကွေးသောနှင့် မြန်ဆန်သော fiber အစုအဝေးများကို ဖော်ထုတ်နိုင်သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာက အမျိုးအစား 2X fiber များသည် အခြား fast-twitch fiber များနှင့် phenotypic အရ ခွဲခြား၍မရကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ထို့အပြင်၊ myosin heavy chain-based classification သည် nemaline myopathies များတွင် myofiber phenotype ကိုဖော်ပြရန် မလုံလောက်ပါ။ အလုံးစုံသော် ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် myosin heavy chain isoforms များထက် ကျော်လွန်၍ ကွဲပြားမှုအရင်းအမြစ်များနှင့်အတူ multidimensional myofiber heterogeneity ကို ညွှန်ပြနေပါသည်။
ဆဲလ်များ၏ ကွဲပြားမှုသည် ဇီဝဗေဒစနစ်အားလုံး၏ မွေးရာပါ အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး ဆဲလ်များသည် တစ်ရှူးများနှင့် ဆဲလ်များ၏ မတူညီသော လိုအပ်ချက်များကို ဖြည့်ဆည်းရန် အထူးပြုနိုင်စေပါသည်။၁ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင် ကွဲပြားမှု၏ ရိုးရာအမြင်မှာ မော်တာနျူရွန်များသည် မော်တာယူနစ်အတွင်းရှိ အမျှင်အမျိုးအစားကို သတ်မှတ်ပေးပြီး အမျှင်အမျိုးအစား (ဆိုလိုသည်မှာ လူသားများတွင် အမျိုးအစား ၁၊ အမျိုးအစား ၂A နှင့် အမျိုးအစား ၂X) ကို myosin heavy chain (MYH) isoforms များ၏ ဝိသေသလက္ခဏာများဖြင့် ဆုံးဖြတ်သည်ဟူ၍ ဖြစ်သည်။၂ ၎င်းသည် အစပိုင်းတွင် ၎င်းတို့၏ pH ATPase မတည်မငြိမ်မှု၊၃၊၄ နှင့် နောက်ပိုင်းတွင် MYH ၏ မော်လီကျူးဖော်ပြချက်ပေါ်တွင် အခြေခံခဲ့သည်။၅ သို့သော် MYH အများအပြားကို မတူညီသော အချိုးအစားများဖြင့် ပူးတွဲဖော်ပြသည့် “ရောနှော” အမျှင်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းနှင့် နောက်ပိုင်းတွင် လက်ခံခြင်းတို့ဖြင့် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များကို ကွဲပြားသော အမျှင်အမျိုးအစားများအဖြစ် မမြင်ဘဲ စဉ်ဆက်မပြတ်အဖြစ် ပိုမိုရှုမြင်လာကြသည်။၆ ဤသို့ဖြစ်နေသော်လည်း၊ နယ်ပယ်သည် myofiber အမျိုးအစားခွဲခြားမှုအတွက် အဓိကအမျိုးအစားခွဲခြားသူအဖြစ် MYH ကို များစွာမှီခိုနေရဆဲဖြစ်ပြီး၊ MYH ဖော်ပြမှုပရိုဖိုင်များနှင့် အမျှင်အမျိုးအစားများ၏ လူသားများနှင့် မတူညီသော အစောပိုင်းကြွက်လေ့လာမှုများ၏ ကန့်သတ်ချက်များနှင့် သိသာထင်ရှားသော ဘက်လိုက်မှုများကြောင့် လွှမ်းမိုးမှုခံရဖွယ်ရှိသည်။၂ မတူညီသော လူ့အရိုးစုကြွက်သားများသည် မတူညီသော အမျှင်အမျိုးအစားကို ပြသသောကြောင့် အခြေအနေသည် ပိုမိုရှုပ်ထွေးလာသည်။ အမျိုးအစားများ။၇ vastus lateralis သည် အလယ်အလတ် (ထို့ကြောင့် ကိုယ်စားပြုသော) MYH ဖော်ပြမှုပရိုဖိုင်ရှိသော ရောနှောကြွက်သားတစ်ခုဖြစ်သည်။၇ ထို့အပြင်၊ ၎င်း၏ နမူနာယူရလွယ်ကူမှုကြောင့် လူသားများတွင် အကောင်းဆုံးလေ့လာထားသော ကြွက်သားဖြစ်စေသည်။
ထို့ကြောင့် အစွမ်းထက်သော “omics” ကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်မျိုးစုံမှုကို ဘက်မလိုက်သော စုံစမ်းစစ်ဆေးမှုသည် အရေးကြီးသော်လည်း စိန်ခေါ်မှုတစ်ရပ်လည်းဖြစ်သည်၊ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအားဖြင့် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ ဘက်စုံဖွဲ့စည်းထားသော သဘောသဘာဝကြောင့်ဖြစ်သည်။ သို့သော် transcriptomics8,9 နှင့် proteomics10 နည်းပညာများသည် မကြာသေးမီနှစ်များအတွင်း နည်းပညာတိုးတက်မှုအမျိုးမျိုးကြောင့် အာရုံခံနိုင်စွမ်းတွင် တော်လှန်ရေးတစ်ရပ်ကို ကြုံတွေ့ခဲ့ရပြီး single-fiber resolution တွင် အရိုးစုကြွက်သားများကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာနိုင်စေခဲ့သည်။ ရလဒ်အနေဖြင့် single-fiber မျိုးစုံမှုနှင့် atrophic stimuli နှင့် အိုမင်းရင့်ရော်မှုအပေါ် ၎င်းတို့၏တုံ့ပြန်မှုကို ဖော်ထုတ်ရာတွင် သိသာထင်ရှားသောတိုးတက်မှုများ ရှိခဲ့သည်11,12,13,14,15,16,17,18။ အရေးကြီးသည်မှာ ဤနည်းပညာတိုးတက်မှုများသည် ဆေးခန်းအသုံးချမှုများရှိပြီး ရောဂါနှင့်ဆက်စပ်နေသော dysregulation ကို ပိုမိုအသေးစိတ်နှင့် တိကျစွာ ဖော်ထုတ်နိုင်စေပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ အဖြစ်အများဆုံး အမွေဆက်ခံထားသော ကြွက်သားရောဂါများ (MIM 605355 နှင့် MIM 161800) ထဲမှ တစ်ခုဖြစ်သည့် nemaline myopathy ၏ pathophysiology သည် ရှုပ်ထွေးပြီး ရှုပ်ထွေးပါသည်။19,20 ထို့ကြောင့် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ dysregulation ကို ပိုမိုကောင်းမွန်စွာ ဖော်ထုတ်ခြင်းသည် ဤရောဂါအကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ နားလည်မှုတွင် သိသာထင်ရှားသော တိုးတက်မှုများကို ဦးတည်စေနိုင်သည်။
လူ့ခန္ဓာကိုယ်ဇီဝစစ်ဆေးမှုနမူနာများမှ ကိုယ်တိုင်ခွဲထုတ်ထားသော တစ်ခုတည်းသော အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ transcriptomic နှင့် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် နည်းလမ်းများကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့ကို အမျှင်ထောင်ပေါင်းများစွာတွင် အသုံးချခဲ့သဖြင့် လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ ဆဲလ်ကွဲပြားမှုကို စုံစမ်းစစ်ဆေးနိုင်ခဲ့သည်။ ဤလုပ်ငန်းတွင်၊ ကြွက်သားအမျှင်များ၏ transcriptomic နှင့် proteomic phenotyping ၏ စွမ်းအားကို ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ပြီး metabolic၊ ribosomal နှင့် cellular junctional ပရိုတိန်းများကို interfiber ကွဲပြားမှု၏ သိသာထင်ရှားသော အရင်းအမြစ်များအဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ ဤ proteomic workflow ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ MYH အပေါ်အခြေခံ၍ fiber အမျိုးအစားနှင့်မသက်ဆိုင်သော non-oxidative fibers များဆီသို့ ညှိနှိုင်းပြောင်းလဲခြင်းကို ဖော်ပြသည့် single skeletal muscle fibers များတွင် nematode myopathy ၏ clinical relevance ကို ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ဖော်နိုင်ခဲ့သည်။
လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ မတူကွဲပြားမှုကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ တစ်ခုတည်းသော အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ transcriptome နှင့် proteome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ဖွင့်ရန် workflow နှစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 1A နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 1A)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် နမူနာသိုလှောင်ခြင်းနှင့် RNA နှင့် ပရိုတိန်းသမာဓိကို ထိန်းသိမ်းခြင်းမှသည် ချဉ်းကပ်မှုတစ်ခုစီအတွက် throughput ကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်လုပ်ဆောင်ခြင်းအထိ နည်းလမ်းဆိုင်ရာအဆင့်များစွာကို တီထွင်ပြီး အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ transcriptome ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ ၎င်းကို reverse transcription ၏ ကနဦးအဆင့်တွင် နမူနာ-သီးသန့် မော်လီကျူးဘားကုဒ်များ ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် အောင်မြင်ခဲ့ပြီး၊ ထိရောက်သော downstream processing အတွက် အမျှင် ၉၆ ခုကို စုစည်းနိုင်စေခဲ့သည်။ ရိုးရာ single-cell ချဉ်းကပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပိုမိုနက်ရှိုင်းသော sequencing (အမျှင်တစ်ခုလျှင် ±၁ သန်းဖတ်ရှုမှု) သည် transcriptome data ကို ပိုမိုကြွယ်ဝစေခဲ့သည်။ ၂၁ proteomics အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် timsTOF mass spectrometer တွင် DIA-PASEF data ရယူခြင်းနှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော တိုတောင်းသော chromatographic gradient (၂၁ မိနစ်) ကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး throughput မြင့်မားမှုကို ထိန်းသိမ်းထားခဲ့သည်။ ၂၂,၂၃ ကျန်းမာသော အရိုးကြွက်သားအမျှင်များ၏ ကွဲပြားမှုကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ ကျန်းမာသော အရွယ်ရောက်ပြီးသူ အလှူရှင် ၁၄ ဦးထံမှ တစ်ဦးချင်း အမျှင် ၁,၀၅၀ ၏ transcriptome များနှင့် ကျန်းမာသော အရွယ်ရောက်ပြီးသူ အလှူရှင် ၅ ဦးထံမှ အမျှင် ၁၀၃၈ ၏ proteome များကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြားသတ်မှတ်ခဲ့ပါသည် (နောက်ဆက်တွဲဇယား ၁)။ ဤစာတမ်းတွင်၊ ဤဒေတာစုများကို အသီးသီး 1,000-fiber transcriptomes နှင့် proteomes များအဖြစ် ရည်ညွှန်းပါသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ ချဉ်းကပ်မှုသည် 1,000-fiber transcriptomic နှင့် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများတွင် စုစုပေါင်း 27,237 transcriptomic နှင့် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများတွင် transcriptomic ၂၇,၂၃၇ ခုနှင့် ပရိုတိန်း ၂,၉၈၃ ခုကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၁က၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာစု ၁-၂)။ ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော မျိုးဗီဇ ၁,၀၀၀ ကျော်နှင့် အမျှင်တစ်ခုလျှင် ၅၀% တရားဝင်တန်ဖိုးများအတွက် transcriptomic နှင့် proteomic dataset များကို စစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ transcriptome နှင့် proteome ရှိ အမျှင် ၉၂၅ ခုနှင့် ၉၇၄ ခုအတွက် နောက်ဆက်တွဲ ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို အသီးသီး ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ ပျမ်းမျှ မျိုးဗီဇ ၄၂၅၇ ± ၁၅၅၇ ခုနှင့် ပရိုတင်း ၂၀၁၅ ± ၂၃၄ ခု (ပျမ်းမျှ ± SD) ကို အမျှင်တစ်ခုလျှင် တွေ့ရှိရပြီး လူတစ်ဦးချင်းစီအကြား ကွဲပြားမှု အကန့်အသတ်ရှိသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံများ 1B–C၊ နောက်ဆက်တွဲ ဒေတာအစုံ ၃–၄)။ သို့သော်၊ ဘာသာရပ်အတွင်း ကွဲပြားမှုသည် ပါဝင်သူများတွင် ပိုမိုသိသာထင်ရှားပြီး မတူညီသော အရှည်နှင့် ဖြတ်ပိုင်းဧရိယာများရှိသော အမျှင်များအကြား RNA/ပရိုတင်းထွက်ရှိမှု ကွာခြားမှုကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။ ပရိုတင်းအများစု (>၂၀၀၀) အတွက်၊ ကွဲပြားမှုကိန်းဂဏန်းသည် ၂၀% အောက်ရှိသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ ၁D)။ နည်းလမ်းနှစ်ခုစလုံးသည် ကြွက်သားကျုံ့ခြင်းအတွက် အရေးကြီးသော မြင့်မားစွာဖော်ပြသော လက်မှတ်များပါရှိသော မှတ်တမ်းများနှင့် ပရိုတင်းများ၏ ကျယ်ပြန့်သော dynamic range ကို ဖမ်းယူနိုင်စေခဲ့သည် (ဥပမာ ACTA1၊ MYH2၊ MYH7၊ TNNT1၊ TNNT3) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံများ 1E–F)။ ဖော်ထုတ်ထားသော အင်္ဂါရပ်အများစုသည် transcriptomic နှင့် proteomic datasets များအကြားတွင် ဘုံဖြစ်ပြီး (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1G)၊ ဤအင်္ဂါရပ်များ၏ ပျမ်းမျှ UMI/LFQ ပြင်းထန်မှုများသည် ကျိုးကြောင်းဆီလျော်စွာ ကောင်းမွန်စွာ ဆက်စပ်နေပါသည် (r = 0.52) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1H)။
Transcriptomics နှင့် proteomics workflow (BioRender.com ဖြင့် ဖန်တီးထားသည်)။ MYH7၊ MYH2 နှင့် MYH1 အတွက် BD Dynamic range curves များနှင့် fiber type assignment အတွက် တွက်ချက်ထားသော thresholds။ E, F transcriptomics နှင့် proteomics datasets များတွင် fiber များတစ်လျှောက် MYH expression ၏ ဖြန့်ဖြူးမှု။ G, H MYH-based fiber type ဖြင့် အရောင်ခြယ်ထားသော transcriptomics နှင့် proteomics အတွက် Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) plots။ I, J transcriptomics နှင့် proteomics datasets များတွင် MYH7၊ MYH2 နှင့် MYH1 expression ကိုပြသသည့် Feature plots။
omics datasets များတွင် MYH expression ၏ မြင့်မားသော sensitivity နှင့် dynamic range ကို အခွင့်ကောင်းယူသည့် optimized approach ကို အသုံးပြု၍ MYH-based fiber type ကို fiber တစ်ခုချင်းစီသို့ သတ်မှတ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့ ကနဦး စတင်ခဲ့ပါသည်။ ယခင်လေ့လာမှုများသည် fiber များကို MYHs11,14,24 ၏ fixed percentage expression အပေါ်အခြေခံ၍ pure type 1, type 2A, type 2X သို့မဟုတ် mixed အဖြစ် label လုပ်ရန် arbitrary thresholds များကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ fiber များကို type လုပ်ဖို့အသုံးပြုခဲ့တဲ့ MYHs အလိုက် fiber တစ်ခုစီရဲ့ expression ကို အဆင့်သတ်မှတ်တဲ့ ကွဲပြားတဲ့ approach ကို ကျွန်ုပ်တို့ အသုံးပြုခဲ့ပါတယ်- MYH7, MYH2, နှင့် MYH1, type 1, type 2A, နှင့် type 2X fiber များနှင့် သက်ဆိုင်ပါသည်။ ထို့နောက် ရလဒ် curve တစ်ခုစီ၏ inflection point ကို သင်္ချာနည်းဖြင့် တွက်ချက်ပြီး MYH တစ်ခုစီအတွက် positive (threshold အထက်) သို့မဟုတ် negative (threshold အောက်) အဖြစ် fiber များကို သတ်မှတ်ရန် threshold အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့ပါတယ် (ပုံ 1B–D)။ ဤ data များက MYH7 (ပုံ 1B) နှင့် MYH2 (ပုံ 1C) တို့သည် protein level နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက RNA level တွင် ပိုမိုကွဲပြားသော on/off expression profile များရှိကြောင်း ပြသနေပါသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ ပရိုတင်းအဆင့်တွင်၊ MYH7 ကိုဖော်ပြခြင်းမရှိသော အမျှင်အနည်းငယ်သာရှိပြီး မည်သည့်အမျှင်မျှ 100% MYH2 ဖော်ပြမှုမရှိပါ။ ထို့နောက်တွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် MYH-based fiber အမျိုးအစားများကို dataset တစ်ခုစီရှိ fiber အားလုံးသို့ သတ်မှတ်ရန် ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသော expression thresholds များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ MYH7+/MYH2-/MYH1- fiber များကို အမျိုးအစား 1 အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့ပြီး MYH7-/MYH2+/MYH1+ fiber များကို ရောနှောအမျိုးအစား 2A/2X အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည် (အပြည့်အစုံဖော်ပြချက်အတွက် နောက်ဆက်တွဲဇယား 2 ကိုကြည့်ပါ)။ Fiber အားလုံးကို ပေါင်းစပ်လိုက်သောအခါ၊ RNA (ပုံ 1E) နှင့် ပရိုတင်း (ပုံ 1F) အဆင့်နှစ်ခုလုံးတွင် MYH-based fiber အမျိုးအစားများ၏ နှိုင်းယှဉ်ဖွဲ့စည်းမှုသည် မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း လူတစ်ဦးချင်းစီအလိုက် ကွဲပြားနေသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 2A)။ Fiber အများစုကို အမျိုးအစား 1 (34–35%) သို့မဟုတ် အမျိုးအစား 2A (36–38%) အဖြစ် အမျိုးအစားခွဲခြားထားသော်လည်း ရောနှောအမျိုးအစား 2A/2X fiber များစွာကိုလည်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (16–19%)။ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်မှာ သန့်စင်သော အမျိုးအစား 2X အမျှင်များကို RNA အဆင့်တွင်သာ ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း ပရိုတင်းအဆင့်တွင် မတွေ့ရှိနိုင်ခြင်းဖြစ်ပြီး၊ မြန်ဆန်သော MYH ဖော်ပြမှုကို အနည်းဆုံး တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း မှတ်တမ်းတင်ပြီးနောက် ထိန်းညှိပေးသည်ဟု ညွှန်ပြနေသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် antibody-based dot blotting ကို အသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့၏ proteomics-based MYH fiber typing နည်းလမ်းကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး နည်းလမ်းနှစ်ခုစလုံးသည် သန့်စင်သော အမျိုးအစား 1 နှင့် အမျိုးအစား 2A အမျှင်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရာတွင် 100% သဘောတူညီချက်ရရှိခဲ့သည် (Supplementary Figure 2B ကိုကြည့်ပါ)။ သို့သော်၊ proteomics-based ချဉ်းကပ်မှုသည် ပိုမိုအာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိပြီး ရောနှောထားသော အမျှင်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရာတွင် ပိုမိုထိရောက်မှုရှိသည်။ နှင့် အမျှင်တစ်ခုစီတွင် MYH မျိုးဗီဇတစ်ခုစီ၏ အချိုးအစားကို ပမာဏသတ်မှတ်ရာတွင် ပိုမိုထိရောက်မှုရှိသည်။ ဤဒေတာသည် skeletal muscle fiber အမျိုးအစားများကို လက္ခဏာရပ်ဖော်ပြရန် objective၊ အလွန်အာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိသော omics-based ချဉ်းကပ်မှုကို အသုံးပြုခြင်း၏ ထိရောက်မှုကို ပြသသည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် transcriptomics နှင့် proteomics မှ ပေးအပ်သော ပေါင်းစပ်အချက်အလက်များကို အသုံးပြု၍ myofibers များကို ၎င်းတို့၏ ပြီးပြည့်စုံသော transcriptome သို့မဟုတ် proteome အပေါ် အခြေခံ၍ အရာဝတ္ထုအလိုက် အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့ပါသည်။ dimensionality ကို အဓိကအစိတ်အပိုင်းခြောက်ခု (Supplementary Figures 3A–B) အထိ လျှော့ချရန် uniform manifold approximation and projection (UMAP) နည်းလမ်းကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် transcriptome (ပုံ 1G) နှင့် proteome (ပုံ 1H) တွင် myofiber variability ကို မြင်ယောင်နိုင်ခဲ့ပါသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ myofibers များကို transcriptomics သို့မဟုတ် proteomics datasets များတွင် ပါဝင်သူများ (Supplementary Figures 3C–D) သို့မဟုတ် စမ်းသပ်မှုရက်များ (Supplementary Figure 3E) အလိုက် အုပ်စုမဖွဲ့ခဲ့ပါ၊ ၎င်းသည် skeletal muscle fibers များတွင် subject အတွင်း variability သည် subject အကြား variability ထက် ပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ညွှန်ပြနေပါသည်။ UMAP plot တွင် "မြန်ဆန်သော" နှင့် "နှေးကွေးသော" myofibers များကို ကိုယ်စားပြုသော ကွဲပြားသော cluster နှစ်ခု ပေါ်ပေါက်လာပါသည် (ပုံ 1G–H)။ MYH7+ (နှေးကွေး) myofibers များကို UMAP1 ၏ positive pole တွင် စုပုံထားပြီး MYH2+ နှင့် MYH1+ (မြန်ဆန်သော) myofibers များကို UMAP1 ၏ negative pole တွင် စုပုံထားသည် (ပုံ 1I–J)။ သို့သော်၊ MYH expression အပေါ်အခြေခံ၍ fast-twitch fiber အမျိုးအစားများ (ဆိုလိုသည်မှာ အမျိုးအစား 2A၊ အမျိုးအစား 2X သို့မဟုတ် ရောနှော 2A/2X) အကြား ခွဲခြားမှုတစ်စုံတစ်ရာ မပြုလုပ်ခဲ့ပါ၊ ၎င်းသည် MYH1 (ပုံ 1I–J) သို့မဟုတ် အခြားဂန္ထဝင် 2X myofiber markers များဖြစ်သည့် ACTN3 သို့မဟုတ် MYLK2 (Supplementary Figs 4A–B) expression သည် transcriptome သို့မဟုတ် proteome တစ်ခုလုံးကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသောအခါ မတူညီသော myofiber အမျိုးအစားများကို မခွဲခြားကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ထို့အပြင်၊ MYH2 နှင့် MYH7 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက transcripts သို့မဟုတ် ပရိုတိန်းအနည်းငယ်သာ MYH1 (Supplementary Figs. 4C–H) နှင့် အပြုသဘောဆက်စပ်နေပြီး MYH1 ပေါများမှုသည် myofiber transcriptome/proteome ကို အပြည့်အဝ ထင်ဟပ်ခြင်းမရှိကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ UMAP အဆင့်တွင် MYH isoform သုံးခု၏ ရောနှောဖော်ပြချက်ကို အကဲဖြတ်သောအခါ အလားတူကောက်ချက်များ ရရှိခဲ့ပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 4I–J)။ ထို့ကြောင့်၊ MYH ပမာဏတစ်ခုတည်းအပေါ် အခြေခံ၍ transcript level တွင် 2X အမျှင်များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သော်လည်း၊ transcriptome သို့မဟုတ် proteome တစ်ခုလုံးကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသောအခါ MYH1+ အမျှင်များသည် အခြားမြန်ဆန်သော အမျှင်များနှင့် ခွဲခြား၍မရပါ။
MYH ထက်ကျော်လွန်၍ နှေးကွေးသောအမျှင် မျိုးကွဲမှုကို ကနဦးစူးစမ်းလေ့လာခြင်းအနေဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် တည်ထောင်ထားသော နှေးကွေးသောအမျှင်အမျိုးအစား-သီးသန့်ပရိုတိန်းလေးခုဖြစ်သည့် TPM3၊ TNNT1၊ MYL3 နှင့် ATP2A22 တို့ကို အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။ နှေးကွေးသောအမျှင်မျိုးကွဲများသည် transcriptomics (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5A) နှင့် proteomics (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5B) နှစ်မျိုးလုံးတွင် MYH7 နှင့် ပြီးပြည့်စုံသော Pearson ဆက်စပ်မှုများ မြင့်မားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ နှေးကွေးသောအမျှင်များ၏ ၂၅% နှင့် ၃၃% ခန့်ကို transcriptomics (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5C) နှင့် proteomics (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5D) ရှိ မျိုးဗီဇ/ပရိုတိန်းမျိုးကွဲအားလုံးမှ သန့်စင်သော နှေးကွေးသောအမျှင်များအဖြစ် အသီးသီးခွဲခြားထားခြင်းမရှိပါ။ ထို့ကြောင့် မျိုးဗီဇ/ပရိုတိန်းမျိုးကွဲများစွာအပေါ် အခြေခံ၍ နှေးကွေးသောအမျှင်ခွဲခြားမှုသည် အမျှင်အမျိုးအစား-သီးသန့်ဖြစ်သည်ဟု သိရှိထားသော ပရိုတိန်းများအတွက်ပင် အပိုရှုပ်ထွေးမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ ၎င်းသည် တစ်ခုတည်းသော မျိုးဗီဇ/ပရိုတိန်းမိသားစု၏ isoforms များအပေါ် အခြေခံ၍ အမျှင်ခွဲခြားမှုသည် ကြွက်သားအမျှင်များ၏ စစ်မှန်သော မျိုးကွဲမှုကို လုံလောက်စွာ ထင်ဟပ်နိုင်မည် မဟုတ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
omics မော်ဒယ်တစ်ခုလုံး၏ စကေးတွင် လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များ၏ phenotypic variability ကို ထပ်မံစူးစမ်းရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် principal component analysis (PCA) ကို အသုံးပြု၍ အချက်အလက်၏ unbiased dimensionality reduction ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 2A)။ UMAP plot များနှင့်ဆင်တူသည်မှာ ပါဝင်သူ သို့မဟုတ် စမ်းသပ်မှုနေ့သည် PCA အဆင့်တွင် fiber clustering ကို လွှမ်းမိုးမှုမရှိပါ (Supplementary Figures 6A–C)။ dataset နှစ်ခုလုံးတွင်၊ MYH-based fiber type ကို PC2 မှ ရှင်းပြခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် slow-twitch type 1 fibers cluster နှင့် fast-twitch type 2A၊ type 2X နှင့် ရောနှောထားသော 2A/2X fibers များပါ၀င်သည့် ဒုတိယ cluster ကို ပြသထားသည် (ပုံ 2A)။ dataset နှစ်ခုလုံးတွင်၊ ဤ cluster နှစ်ခုကို ရောနှောထားသော type 1/2A fibers အနည်းငယ်ဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ အဓိက PC drivers များ၏ overrepresentation analysis သည် PC2 ကို contractile နှင့် metabolic signatures များဖြင့် မောင်းနှင်ကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ 2B နှင့် Supplementary Figures 6D–E၊ Supplementary Datasets 5–6)။ အလုံးစုံသော် MYH-based fiber အမျိုးအစားသည် PC2 တစ်လျှောက် စဉ်ဆက်မပြတ်ပြောင်းလဲမှုကို ရှင်းပြရန် လုံလောက်ကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သော်လည်း၊ fast cluster အတွင်း transcriptome တစ်လျှောက်တွင် ဖြန့်ဝေထားသော 2X fiber များဟုခေါ်သော fiber များမှလွဲ၍ ဖြစ်သည်။
A. MYH ကိုအခြေခံ၍ fiber အမျိုးအစားအလိုက် အရောင်ခြယ်ထားသော transcriptome နှင့် proteome dataset များ၏ Principal component analysis (PCA) plots။ B. PC2 နှင့် PC1 ရှိ transcript နှင့် protein drivers များ၏ enrichment analysis။ clusterProfiler package ကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး Benjamini-Hochberg ချိန်ညှိထားသော p-value များ။ C, D. transcriptome ရှိ intercellular adhesion gene ontology (GO) term များနှင့် proteome ရှိ costamere GO term များအရ အရောင်ခြယ်ထားသော PCA plots။ မြှားများသည် transcript နှင့် protein drivers များနှင့် ၎င်းတို့၏ ဦးတည်ရာများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ E, F. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) သည် နှေးကွေး/မြန်ဆန်သော fiber အမျိုးအစားနှင့်မသက်ဆိုင်သော expression gradient များကိုပြသသည့် ဆေးခန်းဆိုင်ရာ သက်ဆိုင်ရာအင်္ဂါရပ်များ၏ plots များပါရှိသည်။ G, H. transcriptomes နှင့် proteomes ရှိ PC2 နှင့် PC1 drivers များအကြား ဆက်စပ်မှုများ။
မမျှော်လင့်ဘဲ၊ MYH-based myofiber အမျိုးအစားသည် ဒုတိယအမြင့်ဆုံး variability (PC2) ကိုသာ ရှင်းပြခဲ့ပြီး MYH-based myofiber အမျိုးအစား (PC1) နှင့် မသက်ဆိုင်သော အခြားဇီဝဗေဒဆိုင်ရာအချက်များသည် skeletal muscle fiber heterogeneity ကို ထိန်းညှိရာတွင် အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ PC1 ရှိ ထိပ်တန်း drivers များ၏ overrepresentation analysis အရ PC1 ရှိ variability ကို cell-cell adhesion နှင့် transcriptome ရှိ ribosome ပါဝင်မှုနှင့် proteome ရှိ costameres နှင့် ribosomal protein များဖြင့် အဓိကဆုံးဖြတ်ထားကြောင်း ဖော်ထုတ်တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 2B နှင့် Supplementary Figures 6D–E၊ Supplementary Data Set 7)။ skeletal muscle တွင် costameres များသည် Z-disc ကို sarcolemma နှင့် ချိတ်ဆက်ပေးပြီး force transmission နှင့် signaling တွင် ပါဝင်ပါသည်။ 25 cell-cell adhesion (transcriptome၊ ပုံ 2C) နှင့် costamere (proteome၊ ပုံ 2D) features များကို အသုံးပြု၍ Annotated PCA plots များသည် PC1 တွင် ဘယ်ဘက် shift ပြင်းထန်စွာ ပေါ်လာပြီး ဤ features များသည် အချို့သော fibers များတွင် ကြွယ်ဝကြောင်း ညွှန်ပြသည်။
UMAP အဆင့်တွင် myofiber clustering ကို ပိုမိုအသေးစိတ်စစ်ဆေးခြင်းဖြင့် အင်္ဂါရပ်အများစုသည် myofiber subcluster-specific ထက် myofiber type-independent MYH-based expression gradient ကို ပြသကြောင်း ဖော်ပြသည်။ ဤဆက်လက်ဖြစ်ပေါ်မှုကို CHCHD10 (neuromuscular disease)၊ SLIT3 (muscle atrophy)၊ CTDNEP1 (muscle disease) ကဲ့သို့သော ရောဂါဗေဒအခြေအနေများနှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများစွာအတွက် တွေ့ရှိခဲ့ရသည် (ပုံ 2E)။ ဤဆက်လက်ဖြစ်ပေါ်မှုကို အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများ (UGDH)၊ insulin signaling (PHIP) နှင့် transcription (HIST1H2AB) နှင့် ဆက်စပ်နေသော ပရိုတိန်းများ (ပုံ 2F) အပါအဝင် proteome တစ်လျှောက်တွင်လည်း တွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ ဤဒေတာသည် မတူညီသော myofibers များတစ်လျှောက် fiber type-independent slow/fast twitch heterogeneity တွင် ဆက်လက်ဖြစ်ပေါ်မှုကို ညွှန်ပြသည်။
စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက PC2 ရှိ driver genes များသည် transcriptome-proteome correlation (r = 0.663) ကို ကောင်းမွန်သော ပြသခဲ့သည် (ပုံ 2G)၊ ၎င်းသည် slow-fast-twitch fiber အမျိုးအစားများနှင့် အထူးသဖြင့် skeletal muscle fiber များ၏ contractile နှင့် metabolic properties များကို transcriptional ဖြင့် ထိန်းညှိထားကြောင်း ဖော်ပြသည်။ သို့သော် PC1 ရှိ driver genes များသည် transcriptome-proteome correlation (r = -0.027) ကို မပြသခဲ့ပါ (ပုံ 2H)၊ ၎င်းသည် slow/fast-twitch fiber အမျိုးအစားများနှင့် မသက်ဆိုင်သော variations များကို post-transcriptional ဖြင့် အများအားဖြင့် ထိန်းညှိထားကြောင်း ဖော်ပြသည်။ PC1 ရှိ variations များကို ribosomal gene ontology terms များဖြင့် အဓိကရှင်းပြထားပြီး ribosome များသည် protein translation တွင် တက်ကြွစွာပါဝင်ခြင်းနှင့် လွှမ်းမိုးခြင်းဖြင့် ဆဲလ်တွင် အရေးပါပြီး အထူးပြုအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သောကြောင့်၊31 ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤမမျှော်လင့်ထားသော ribosomal heterogeneity ကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် စတင်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် GOCC အသုံးအနှုန်း “ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရိုင်ဗိုဆုမ်း” (ပုံ 3A) တွင် ပရိုတင်းများ၏ ဆွေမျိုးပေါများမှုအလိုက် ပရိုတိန်းအဓိက အစိတ်အပိုင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ကွက်လပ်ကို ဦးစွာ အရောင်ခြယ်ခဲ့ပါသည်။ ဤအသုံးအနှုန်းသည် PC1 ၏ အပြုသဘောဆောင်သောဘက်တွင် ကြွယ်ဝသော်လည်း၊ gradient အနည်းငယ်ကို ဖြစ်ပေါ်စေသော်လည်း၊ ရိုင်ဗိုဆုမ်းပရိုတိန်းများသည် PC1 ၏ နှစ်ဖက်စလုံးတွင် ပိုင်းခြားခြင်းကို မောင်းနှင်ပါသည် (ပုံ 3A)။ PC1 ၏ အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သောဘက်တွင် ကြွယ်ဝသော ရိုင်ဗိုဆုမ်းပရိုတိန်းများတွင် RPL18၊ RPS18 နှင့် RPS13 (ပုံ 3B) တို့ ပါဝင်ပြီး၊ RPL31၊ RPL35 နှင့် RPL38 (ပုံ 3C) သည် PC1 ၏ အပြုသဘောဆောင်သောဘက်တွင် အဓိက မောင်းနှင်အားများ ဖြစ်ပါသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ RPL38 နှင့် RPS13 တို့သည် အခြားတစ်ရှူးများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အရိုးစုကြွက်သားတွင် မြင့်မားစွာ ဖော်ပြခံရပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7A)။ PC1 ရှိ ဤထူးခြားသော ရိုင်ဗိုဆုမ်းလက္ခဏာများကို transcriptome တွင် မတွေ့ရှိရပါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7B)၊ ၎င်းသည် post-transcriptional regulation ကို ညွှန်ပြနေပါသည်။
A. ပရိုတီယိုမ်တစ်လျှောက်ရှိ ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရိုင်ဘိုဇိုမယ် မျိုးရိုးဗီဇ အွန်တိုလော်ဂျီ (GO) အသုံးအနှုန်းများအလိုက် အရောင်ခြယ်ထားသော အဓိက အစိတ်အပိုင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (PCA) ကွက်။ မြှားများသည် PCA ကွက်တွင် ပရိုတိန်းကြားဝင်ပြောင်းလဲမှု၏ ဦးတည်ရာကို ညွှန်ပြသည်။ မျဉ်းအရှည်သည် ပေးထားသော ပရိုတိန်းအတွက် အဓိက အစိတ်အပိုင်း ရမှတ်နှင့် ကိုက်ညီသည်။ B၊ C။ RPS13 နှင့် RPL38 အတွက် PCA အင်္ဂါရပ်ကွက်များ။ D. ဆိုက်တိုပလာစမစ် ရိုင်ဘိုဇိုမယ် ပရိုတိန်းများ၏ ကြီးကြပ်မှုမရှိဘဲ အဆင့်ဆင့် clustering ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ E. အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် ကွဲပြားခြားနားသော ပေါများမှုရှိသော ရိုင်ဘိုဇိုမယ် ပရိုတိန်းများကို မီးမောင်းထိုးပြသည့် 80S ရိုင်ဘိုဆုမ်း (PDB: 4V6X) ၏ ဖွဲ့စည်းပုံပုံစံ။ F. mRNA ထွက်ပေါက်လမ်းကြောင်းအနီးတွင် တည်နေရာအရ ကွဲပြားခြားနားသော stoichiometry ရှိသော ရိုင်ဘိုဇိုမယ် ပရိုတိန်းများ။
ရိုင်ဘိုဆိုမ် မျိုးကွဲနှင့် အထူးပြုခြင်းဆိုင်ရာ သဘောတရားများကို ယခင်က အဆိုပြုခဲ့ပြီးဖြစ်ပြီး၊ ကွဲပြားသော ရိုင်ဘိုဆိုမ် မျိုးကွဲများ ရှိနေခြင်း (ရိုင်ဘိုဆိုမ် မျိုးကွဲ) သည် သီးခြား mRNA transcript pools34 ၏ ရွေးချယ်ဘာသာပြန်ခြင်း (ရိုင်ဘိုဆိုမ် အထူးပြုခြင်း) မှတစ်ဆင့် မတူညီသော တစ်ရှူးများ32 နှင့် ဆဲလ်များ33 ရှိ ပရိုတင်းဘာသာပြန်ခြင်းကို တိုက်ရိုက်လွှမ်းမိုးနိုင်သည်။ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် ပူးတွဲဖော်ပြသော ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတင်းများ၏ မျိုးကွဲများကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် proteome ရှိ ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတင်းများ၏ unsupervised hierarchical clustering analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 3D၊ Supplementary Data Set 8)။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတင်းများသည် MYH ကို အခြေခံ၍ အမျှင်အမျိုးအစားအလိုက် အစုအဝေးမဖွဲ့ခဲ့ပါ။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတင်းများ၏ ကွဲပြားသော အစုအဝေးသုံးခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ ပထမအစုအဝေး (ribosomal_cluster_1) သည် RPL38 နှင့် ပူးတွဲထိန်းညှိထားပြီး ထို့ကြောင့် အပြုသဘောဆောင်သော PC1 ပရိုဖိုင်ရှိသော အမျှင်များတွင် ဖော်ပြမှု တိုးလာသည်။ ဒုတိယအစုအဝေး (ribosomal_cluster_2) ကို RPS13 နှင့် ပူးတွဲထိန်းညှိပြီး အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော PC1 ပရိုဖိုင်ရှိသော အမျှင်များတွင် မြှင့်တင်ထားသည်။ တတိယအစုအဝေး (ribosomal_cluster_3) သည် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် ညှိနှိုင်းထားသော ကွဲပြားသော ဖော်ပြမှုကို မပြသဘဲ “အဓိက” အရိုးစုကြွက်သား ရိုင်ဘိုဆိုမာပရိုတင်းအဖြစ် သတ်မှတ်နိုင်သည်။ ရိုင်ဘိုဆိုမာအစုအဝေး ၁ နှင့် ၂ နှစ်ခုစလုံးတွင် ယခင်က အခြားဘာသာပြန်ဆိုချက် (ဥပမာ RPL10A၊ RPL38၊ RPS19 နှင့် RPS25) ကို ထိန်းညှိပေးပြီး ဖွံ့ဖြိုးမှုကို လုပ်ဆောင်ရာတွင် လွှမ်းမိုးနိုင်ကြောင်း ပြသထားသည့် ရိုင်ဘိုဆိုမာပရိုတင်းများ (ဥပမာ RPL10A၊ RPL38) ပါရှိသည်။၃၄၊၃၅၊၃၆၊၃၇၊၃၈ PCA ရလဒ်များနှင့်အညီ၊ အမျှင်များတစ်လျှောက် ဤရိုင်ဘိုဆိုမာပရိုတင်းများ၏ ကွဲပြားသောကိုယ်စားပြုမှုကို လေ့လာတွေ့ရှိရခြင်းသည်လည်း စဉ်ဆက်မပြတ်ဖြစ်မှုကို ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၇ဂ)။
ရိုင်ဗိုဆုမ်းအတွင်းရှိ မျိုးကွဲများစွာပါဝင်သော ရိုင်ဗိုဆုမ်းပရိုတိန်းများ၏ တည်နေရာကို မြင်ယောင်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် human 80S ရိုင်ဗိုဆုမ်း၏ ဖွဲ့စည်းပုံပုံစံ (Protein Data Bank: 4V6X) (ပုံ 3E) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ မတူညီသော ရိုင်ဗိုဆုမ်းအစုအဝေးများနှင့်သက်ဆိုင်သော ရိုင်ဗိုဆုမ်းပရိုတိန်းများကို ခွဲထုတ်ပြီးနောက်၊ ၎င်းတို့၏တည်နေရာများသည် အနီးကပ်ညှိနှိုင်းမှုမရှိသောကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ချဉ်းကပ်မှုသည် ရိုင်ဗိုဆုမ်း၏ အချို့သောဒေသများ/အပိုင်းအစများအတွက် ကြွယ်ဝမှုကို မပေးနိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ သို့သော် စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ cluster 2 ရှိ ကြီးမားသော subunit ပရိုတိန်းများ၏ အချိုးအစားသည် cluster 1 နှင့် 3 ထက် နည်းပါးသည် (Supplementary Figure 7D)။ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် ပြောင်းလဲထားသော stoichiometry ရှိသော ပရိုတိန်းများသည် ရိုင်ဗိုဆုမ်းမျက်နှာပြင်တွင် အဓိကတည်ရှိနေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3E)၊ မတူညီသော mRNA လူဦးရေများတွင် internal ribosome entry site (IRES) ဒြပ်စင်များနှင့် အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်နိုင်စွမ်းနှင့် ကိုက်ညီပြီး ထို့ကြောင့် ရွေးချယ်ဘာသာပြန်ဆိုမှုကို ညှိနှိုင်းပေးသည်။ ၄၀၊ ၄၁ ထို့အပြင်၊ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် ပြောင်းလဲထားသော stoichiometry ရှိသော ပရိုတိန်းများစွာသည် mRNA ထွက်ပေါက်ဥမင်လိုဏ်ခေါင်း (ပုံ ၃F) ကဲ့သို့သော လုပ်ဆောင်နိုင်သော ဒေသများအနီးတွင် တည်ရှိပြီး ၎င်းတို့သည် သီးခြား peptide များ၏ translational elongation နှင့် ရပ်တန့်မှုကို ရွေးချယ်၍ ထိန်းညှိပေးသည်။ ၄၂ အနှစ်ချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာက အရိုးစုကြွက်သား ရိုင်ဘိုဆိုမ်ပရိုတိန်းများ၏ stoichiometry သည် မတူညီမှုကိုပြသပြီး အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များအကြား ကွဲပြားမှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် fast- နှင့် slow-twitch fiber signatures များကို ဖော်ထုတ်ရန်နှင့် ၎င်းတို့၏ transcriptional regulation ယန္တရားများကို စူးစမ်းလေ့လာရန် စတင်လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ dataset နှစ်ခုတွင် UMAP မှ သတ်မှတ်ထားသော fast- နှင့် slow-twitch fiber cluster များကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း (ပုံ 1G–H နှင့် 4A–B)၊ transcriptomic နှင့် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများသည် အသီးသီး ကွဲပြားစွာ ပေါများသော အင်္ဂါရပ် ၁၃၆၆ ခုနှင့် ၈၀၄ ခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 4A–B၊ Supplementary Datasets 9–12)။ sarcomeres (ဥပမာ၊ tropomyosin နှင့် troponin)၊ excitation-contraction coupling (SERCA isoforms) နှင့် energy metabolism (ဥပမာ၊ ALDOA နှင့် CKB) နှင့် ဆက်စပ်သော signatures များတွင် မျှော်လင့်ထားသည့် ကွဲပြားချက်များကို ကျွန်ုပ်တို့ လေ့လာတွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ protein ubiquitination ကို ထိန်းညှိပေးသော transcripts နှင့် proteins များကို fast- နှင့် slow-twitch fibers (ဥပမာ၊ USP54၊ SH3RF2၊ USP28 နှင့် USP48) တွင် ကွဲပြားစွာ ဖော်ပြခဲ့ပါသည် (ပုံ 4A–B)။ ထို့အပြင်၊ သိုးသငယ်ကြွက်သားအမျှင်အမျိုးအစားများတွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြကြောင်း ယခင်ကပြသခဲ့ပြီး နှလုံးကြွက်သားတွင် SERCA လှုပ်ရှားမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်ဟု ယခင်ကပြသခဲ့သော အဏုဇီဝပရိုတိန်းမျိုးဗီဇ RP11-451G4.2 (DWORF) သည် နှေးကွေးသော အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် သိသိသာသာမြင့်တက်လာခဲ့သည် (ပုံ 4A)။ အလားတူပင်၊ တစ်ဦးချင်းအမျှင်အဆင့်တွင်၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့်ဆက်စပ်သော lactate dehydrogenase isoforms (LDHA နှင့် LDHB၊ ပုံ 4C နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 8A)45,46 ကဲ့သို့သော လူသိများသော လက္ခဏာများအပြင် ယခင်ကမသိရှိသော အမျှင်အမျိုးအစားအလိုက် လက္ခဏာများ (IRX3၊ USP54၊ USP28 နှင့် DPYSL3 ကဲ့သို့) (ပုံ 4C) တွင် သိသာထင်ရှားသော ကွဲပြားချက်များကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ transcriptomic နှင့် proteomic datasets များအကြား ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော အင်္ဂါရပ်များ၏ သိသာထင်ရှားသော ထပ်တူကျမှုအပြင် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8B) sarcomere အင်္ဂါရပ်များ၏ ပိုမိုထင်ရှားသော ကွဲပြားစွာဖော်ပြမှုကြောင့် အဓိကအားဖြင့် မောင်းနှင်သော fold change correlation လည်းရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8C)။ ထူးခြားသည်မှာ အချို့သော လက်မှတ်များ (ဥပမာ USP28၊ USP48၊ GOLGA4၊ AKAP13) သည် proteomic level တွင်သာ post-transcriptional regulation ပြင်းထန်စွာပြသခဲ့ပြီး slow/fast twitch fiber type-specific expression profiles များရှိခဲ့သည် (Supplementary Figure 8C)။
A နှင့် B မီးတောင်ကွက်များသည် ပုံ 1G–H ရှိ uniform manifold approximation and projection (UMAP) ကွက်များဖြင့် ဖော်ထုတ်ထားသော နှေးကွေးသောနှင့် မြန်ဆန်သော cluster များကို နှိုင်းယှဉ်ထားသည်။ အရောင်အစက်များသည် FDR < 0.05 တွင် သိသိသာသာကွဲပြားသော transcripts သို့မဟုတ် ပရိုတိန်းများကို ကိုယ်စားပြုပြီး မှောင်သောအစက်များသည် log change > 1 တွင် သိသိသာသာကွဲပြားသော transcripts သို့မဟုတ် ပရိုတိန်းများကို ကိုယ်စားပြုသည်။ နှစ်လမ်းသွား စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို Benjamini–Hochberg ချိန်ညှိထားသော p တန်ဖိုးများ (transcriptomics) ပါသော DESeq2 Wald စစ်ဆေးမှုကို အသုံးပြု၍ သို့မဟုတ် empirical Bayesian analysis ပါသော Limma linear model နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး မျိုးစုံနှိုင်းယှဉ်မှုများအတွက် Benjamini–Hochberg ချိန်ညှိမှု (proteomics) ပါရှိသည်။ C နှေးကွေးသောနှင့် မြန်ဆန်သော အမျှင်များအကြား ရွေးချယ်ထားသော ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော မျိုးဗီဇများ သို့မဟုတ် ပရိုတိန်းများ၏ Signature plots။ D သိသိသာသာကွဲပြားစွာဖော်ပြသော transcripts နှင့် ပရိုတိန်းများ၏ ကြွယ်ဝမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ ထပ်နေသောတန်ဖိုးများကို dataset နှစ်ခုလုံးတွင် ကြွယ်ဝစေပြီး transcriptome တန်ဖိုးများကို transcriptome တွင်သာ ကြွယ်ဝစေပြီး proteome တန်ဖိုးများကို proteome တွင်သာ ကြွယ်ဝစေသည်။ Benjamini-Hochberg ချိန်ညှိထားသော p-တန်ဖိုးများပါသော clusterProfiler package ကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ E. SCENIC မှဆင်းသက်လာသော regulator specificity scores များနှင့် fiber အမျိုးအစားများအကြား ကွဲပြားသော mRNA expression များအပေါ်အခြေခံ၍ SCENIC မှ ဖော်ထုတ်ထားသော fiber အမျိုးအစားအလိုက် transcription factor များ။ F. နှေးကွေးသော fiber နှင့် မြန်ဆန်သော fiber များအကြား ကွဲပြားစွာဖော်ပြထားသော ရွေးချယ်ထားသော transcription factor များ၏ profileing။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသောကိုယ်စားပြုမှုရှိသော မျိုးဗီဇများနှင့် ပရိုတင်းများ၏ အလွန်အကျွံကိုယ်စားပြုမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 4D၊ ဖြည့်စွက်ဒေတာအစုံ 13)။ အချက်အလက်အစုနှစ်ခုကြား ကွဲပြားသော အင်္ဂါရပ်များအတွက် လမ်းကြောင်းကြွယ်ဝမှုသည် fatty acid β-oxidation နှင့် ketone ဇီဝြဖစ်ပျက်မှုလုပ်ငန်းစဉ်များ (နှေးကွေးသောအမျှင်များ)၊ myofilament/ကြွက်သားကျုံ့ခြင်း (မြန်ဆန်သောနှင့် နှေးကွေးသောအမျှင်များ အသီးသီး) နှင့် carbohydrate catabolic လုပ်ငန်းစဉ်များ (မြန်ဆန်သောအမျှင်များ) ကဲ့သို့သော မျှော်လင့်ထားသည့် ကွာခြားချက်များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ glycogen ဇီဝြဖစ်ပျက်မှုကို ထိန်းညှိပေးသည်ဟု လူသိများသော regulatory နှင့် catalytic phosphatase subunits (PPP3CB၊ PPP1R3D နှင့် PPP1R3A ကဲ့သို့သော အင်္ဂါရပ်များကြောင့် မြန်ဆန်သောအမျှင်များတွင် Serine/threonine ပရိုတင်း phosphatase လုပ်ဆောင်ချက်သည်လည်း မြင့်မားလာပါသည် (47) (ဖြည့်စွက်ပုံများ 8D–E)။ မြန်ဆန်သောအမျှင်များဖြင့် ကြွယ်ဝသော အခြားလမ်းကြောင်းများတွင် proteome ရှိ processing (P-) bodies (YTHDF3၊ TRIM21၊ LSM2) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8F)၊ post-transcriptional regulation (48) တွင် ပါဝင်နိုင်ခြေရှိပြီး transcriptome ရှိ transcription factor activity (SREBF1၊ RXRG၊ RORA) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8G) တို့ ပါဝင်သည်။ နှေးကွေးသောအမျှင်များသည် oxidoreductase activity (BDH1၊ DCXR၊ TXN2) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8H)၊ amide binding (CPTP၊ PFDN2၊ CRYAB) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8I)၊ extracellular matrix (CTSD၊ ADAMTSL4၊ LAMC1) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8J) နှင့် receptor-ligand activity (FNDC5၊ SPX၊ NENF) (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8K) တို့ဖြင့် ကြွယ်ဝသည်။
နှေးကွေး/မြန်ဆန်သော ကြွက်သားအမျှင်အမျိုးအစား ဝိသေသလက္ခဏာများ၏ အခြေခံဖြစ်သော transcriptional regulation ကို ပိုမိုထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SCENIC49 (Supplementary Data Set 14) ကို အသုံးပြု၍ transcription factor enrichment analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ transcription factor အများအပြားသည် မြန်ဆန်သော ကြွက်သားအမျှင်များနှင့် နှေးကွေးသော ကြွက်သားအမျှင်များကြားတွင် သိသိသာသာ ကြွယ်ဝလာပါသည် (ပုံ 4E)။ ၎င်းတွင် ယခင်က မြန်ဆန်သော ကြွက်သားအမျှင်ဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် ဆက်စပ်နေသော MAFA ကဲ့သို့သော transcription factor များအပြင်၊ ကြွက်သားအမျှင်အမျိုးအစားအလိုက် မျိုးဗီဇပရိုဂရမ်များနှင့် ယခင်က မဆက်စပ်ခဲ့သော transcription factor အများအပြား ပါဝင်သည်။ ၎င်းတို့အနက် PITX1၊ EGR1 နှင့် MYF6 တို့သည် မြန်ဆန်သော ကြွက်သားအမျှင်များတွင် အကြွယ်ဝဆုံး transcription factor များဖြစ်သည် (ပုံ 4E)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အားဖြင့်၊ ZSCAN30 နှင့် EPAS1 (HIF2A ဟုလည်း လူသိများသည်) တို့သည် နှေးကွေးသော ကြွက်သားအမျှင်များတွင် အကြွယ်ဝဆုံး transcription factor များဖြစ်သည် (ပုံ 4E)။ ၎င်းနှင့်အညီ၊ MAFA သည် မြန်ဆန်သော ကြွက်သားအမျှင်များနှင့် ကိုက်ညီသော UMAP ဒေသတွင် ပိုမိုမြင့်မားသော အဆင့်များတွင် ဖော်ပြခဲ့ပြီး EPAS1 တွင် ဆန့်ကျင်ဘက် expression pattern ရှိသည် (ပုံ 4F)။
ပရိုတင်းကုဒ်လုပ်သည့် မျိုးဗီဇများအပြင်၊ လူသားဖွံ့ဖြိုးမှုနှင့် ရောဂါများကို ထိန်းညှိပေးရာတွင် ပါဝင်နိုင်သည့် ကုဒ်မပါဝင်သော RNA ဇီဝအမျိုးအစားများစွာ ရှိပါသည်။ ၅၁၊ ၅၂ transcriptome datasets များတွင်၊ ကုဒ်မပါဝင်သော RNA အများအပြားသည် အမျှင်အမျိုးအစား တိကျမှုကို ပြသသည် (ပုံ ၅က နှင့် ဖြည့်စွက်ဒေတာအစုံ ၁၅)၊ LINC01405 အပါအဝင်၊ ၎င်းသည် နှေးကွေးသော အမျှင်များအတွက် အလွန်တိကျပြီး မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကြွက်သားရောဂါရှိသော လူနာများမှ ကြွက်သားများတွင် လျော့နည်းသွားကြောင်း သတင်းပို့ထားသည်။ ၅၃ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေဖြင့်၊ lnc-ERCC5-5 မျိုးဗီဇ (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) ၅၄ နှင့် ကိုက်ညီသော RP11-255P5.3 သည် မြန်ဆန်သော အမျှင်အမျိုးအစား တိကျမှုကို ပြသသည်။ LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) နှင့် RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) နှစ်ခုစလုံးသည် ကြွက်သားများ၏ သီးခြားဖြစ်မှုကို ပြသသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၉A–B)။ ၎င်းတို့၏ 1 Mb ဂျီနိုမ်ရပ်ကွက်အတွင်းတွင် ကျုံ့နိုင်သော မျိုးဗီဇများ မရှိသောကြောင့် အိမ်နီးချင်း ကျုံ့နိုင်သော မျိုးဗီဇများကို ထိန်းညှိခြင်းထက် အမျှင်အမျိုးအစားများကို ထိန်းညှိရာတွင် အထူးပြုအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ LINC01405 နှင့် RP11-255P5.3 တို့၏ နှေးကွေး/မြန်ဆန်သော အမျှင်အမျိုးအစားအလိုက် ဖော်ပြမှုပရိုဖိုင်များကို RNAscope ကို အသုံးပြု၍ အတည်ပြုခဲ့သည် (ပုံ ၅B–C)။
A. နှေးကွေးသောနှင့်အမြန်တွန့်လိမ်သောကြွက်သားအမျှင်များတွင် non-coding RNA transcripts များကို သိသိသာသာထိန်းညှိထားသည်။ B. LINC01405 နှင့် RP11-255P5.3 ၏ နှေးကွေးသောနှင့်အမြန်တွန့်လိမ်သောအမျှင်အမျိုးအစားတိကျမှုကိုပြသသည့် ကိုယ်စားပြု RNAscope ပုံများ။ Scale bar = 50 μm။ C. RNAscope မှဆုံးဖြတ်သည့်အတိုင်း myofiber အမျိုးအစား-သီးသန့် non-coding RNA expression ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = လွတ်လပ်သောလူပုဂ္ဂိုလ်များမှ biopsies ၃ ခု၊ လူတစ်ဦးချင်းစီအတွင်းရှိ မြန်ဆန်သောနှင့်နှေးကွေးသောကြွက်သားအမျှင်များကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း)။ two-tailed Student's t-test ကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Box plot များသည် median နှင့် ပထမနှင့် တတိယ quartiles များကိုပြသပြီး whiskers များသည် အနည်းဆုံးနှင့် အများဆုံးတန်ဖိုးများကို ညွှန်ပြသည်။ D. De novo microbial protein identification workflow (BioRender.com ဖြင့်ဖန်တီးထားသည်)။ E. အဏုဇီဝပရိုတိန်း LINC01405_ORF408:17441:17358 ကို နှေးကွေးသော အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် တိကျစွာဖော်ပြထားသည် (n=5 လွတ်လပ်သောပါဝင်သူများထံမှ ခန္ဓာကိုယ်တစ်သျှူးစစ်ဆေးမှုများ၊ ပါဝင်သူတစ်ဦးစီတွင် မြန်ဆန်သောနှင့် နှေးကွေးသောကြွက်သားအမျှင်များကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း)။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို Limm linear model နည်းလမ်းကို empirical Bayesian ချဉ်းကပ်မှုနှင့် ပေါင်းစပ်အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး p-value ချိန်ညှိမှုဖြင့် မျိုးစုံနှိုင်းယှဉ်မှုများအတွက် Benjamini-Hochberg နည်းလမ်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ Box plot များသည် median၊ ပထမနှင့် တတိယ quartiles များကို ပြသထားပြီး whiskers များသည် အမြင့်ဆုံး/အနည်းဆုံးတန်ဖိုးများကို ညွှန်ပြနေသည်။
မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ non-coding transcripts အများအပြားသည် transcripted microbial ပရိုတိန်းများကို encode လုပ်ကြောင်း၊ ၎င်းတို့အချို့သည် ကြွက်သားလုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းညှိကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ၄၄၊ ၅၅ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော fiber type specificity ရှိသော microbial ပရိုတိန်းများကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 1000 fiber transcriptome dataset တွင်တွေ့ရှိရသော non-coding transcripts (n = 305) ၏ sequences များပါရှိသော custom FASTA ဖိုင်ကို အသုံးပြု၍ ကျွန်ုပ်တို့၏ 1000 fiber proteome dataset ကို ရှာဖွေခဲ့ပါသည် (ပုံ 5D)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် transcripts ၂၂ မျိုးမှ microbial ပရိုတိန်း ၁၉၇ ခုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အနက် ၇၁ ခုသည် နှေးကွေးသောနှင့် မြန်ဆန်သော skeletal muscle fibers အကြား ကွဲပြားစွာ ထိန်းညှိထားသည် (Supplementary Figure 9C နှင့် Supplementary Data Set 16)။ LINC01405 အတွက် microbial ပရိုတိန်းထုတ်ကုန်သုံးမျိုးကို ဖော်ထုတ်ခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အနက် တစ်ခုမှာ ၎င်း၏ transcript နှင့် အလားတူ slow fiber specificity ကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 5E နှင့် Supplementary Figure 9D)။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် LINC01405 ကို နှေးကွေးသော skeletal muscle fibers များအတွက် သီးသန့် microbial ပရိုတိန်းကို encode လုပ်သော gene အဖြစ် ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ကြွက်သားအမျှင်တစ်ခုချင်းစီ၏ ကြီးမားသော ပရိုတီယိုမစ်လက္ခဏာအတွက် ပြည့်စုံသော လုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့ပြီး ကျန်းမာသောအခြေအနေများတွင် အမျှင်ကွဲပြားမှု၏ ထိန်းညှိပေးသည့်အရာများကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ nemaline myopathies များသည် အရိုးကြွက်သားအမျှင်ကွဲပြားမှုကို မည်သို့အကျိုးသက်ရောက်သည်ကို နားလည်ရန် ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ အသုံးပြုခဲ့သည်။ Nemaline myopathies များသည် ကြွက်သားအားနည်းခြင်းကို ဖြစ်စေပြီး ထိခိုက်ခံရသော ကလေးများတွင် အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ အခက်အခဲ၊ ကျောရိုးစောင်းခြင်းနှင့် ခြေလက်လှုပ်ရှားမှု အကန့်အသတ်ရှိခြင်း အပါအဝင် ရှုပ်ထွေးမှုအမျိုးမျိုးကို ခံစားရသည့် မျိုးရိုးလိုက်သည့် ကြွက်သားရောဂါများဖြစ်သည်။ ၁၉,၂၀ ပုံမှန်အားဖြင့် nemaline myopathies များတွင် actin alpha 1 (ACTA1) ကဲ့သို့သော မျိုးရိုးဗီဇများရှိ ရောဂါဖြစ်စေသော မျိုးကွဲများသည် နှေးကွေးသော တွန့်လိမ်သော အမျှင် myofiber ဖွဲ့စည်းမှုကို လွှမ်းမိုးစေသော်လည်း ဤအကျိုးသက်ရောက်မှုသည် ကွဲပြားသည်။ ထင်ရှားသော ခြွင်းချက်တစ်ခုမှာ မြန်ဆန်သော အမျှင်များ လွှမ်းမိုးထားသော troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1) ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် nemaline myopathies များတွင် တွေ့ရှိရသော အရိုးကြွက်သားအမျှင် မမှန်ခြင်း၏ အခြေခံ ကွဲပြားမှုကို ပိုမိုနားလည်ခြင်းသည် ဤရောဂါများနှင့် myofiber အမျိုးအစားအကြား ရှုပ်ထွေးသော ဆက်နွယ်မှုကို ဖော်ထုတ်ရန် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။
ကျန်းမာသော ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက (အုပ်စုတစ်စုလျှင် n=3)၊ ACTA1 နှင့် TNNT1 မျိုးဗီဇများတွင် မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုရှိသော nemaline myopathy လူနာများမှ ခွဲထုတ်ထားသော myofibers များသည် သိသာထင်ရှားသော myofiber atrophy သို့မဟုတ် dystrophy ကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 6A၊ နောက်ဆက်တွဲဇယား 3)။ ရရှိနိုင်သော ပစ္စည်းပမာဏ အကန့်အသတ်ရှိသောကြောင့် ၎င်းသည် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် သိသာထင်ရှားသော နည်းပညာဆိုင်ရာ စိန်ခေါ်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ဤသို့ဖြစ်နေသော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် skeletal myofibers ၂၇၂ ခုတွင် ပရိုတင်း ၂၄၈၅ ခုကို ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်ခဲ့သည်။ အမျှင်တစ်ခုလျှင် အနည်းဆုံး ပမာဏသတ်မှတ်ထားသော ပရိုတင်း ၁၀၀၀ ကို စစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ အမျှင် ၂၅၀ ကို နောက်ဆက်တွဲ bioinformatics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ စစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ အမျှင်တစ်ခုလျှင် ပျမ်းမျှပရိုတင်း ၁၅၇၃ ± ၃၅၉ ခုကို ပမာဏသတ်မှတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 10A၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာအစုံ ၁၇-၁၈)။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ၊ အမျှင်အရွယ်အစား သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသော်လည်း၊ nemaline myopathy လူနာနမူနာများ၏ proteome အနက်သည် အနည်းငယ်သာ လျော့ကျသွားခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ကိုယ်ပိုင် FASTA ဖိုင်များ (non-coding transcripts များအပါအဝင်) ကို အသုံးပြု၍ ဤဒေတာများကို လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် nemaline myopathy လူနာများထံမှ skeletal myofibers ရှိ microbial ပရိုတိန်းငါးမျိုးကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်စေခဲ့သည် (Supplementary Data Set 19)။ proteome ၏ dynamic range သည် သိသိသာသာ ပိုမိုကျယ်ပြန့်ပြီး control group ရှိ total protein များသည် ယခင် 1000-fiber proteome analysis ၏ ရလဒ်များနှင့် ကောင်းစွာ ဆက်စပ်နေသည် (Supplementary Fig. 10B–C)။
A. ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies (NM) တွင် MYH အပေါ်အခြေခံ၍ အမျှင် atrophy သို့မဟုတ် dystrophy နှင့် မတူညီသော အမျှင်အမျိုးအစားများ လွှမ်းမိုးမှုကို ပြသသည့် အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းပုံများ။ စကေးဘား = 100 μm။ ACTA1 နှင့် TNNT1 လူနာများတွင် အစွန်းအထင်းများ ပြန်လည်ဖြစ်ပွားနိုင်စေရန်အတွက်၊ ကိုယ်စားပြုပုံများကို မရွေးချယ်မီ လူနာတစ်ရှူးစစ်ဆေးမှု သုံးကြိမ်ကို နှစ်ကြိမ်မှ သုံးကြိမ်အထိ (ကိစ္စတစ်ခုလျှင် အပိုင်းလေးပိုင်း) အစွန်းအထင်းများ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ B. MYH အပေါ်အခြေခံ၍ ပါဝင်သူများတွင် အမျှင်အမျိုးအစား အချိုးအစား။ C. nemaline myopathies နှင့် ထိန်းချုပ်လူနာများတွင် အရိုးကြွက်သားအမျှင်များ၏ အဓိကအစိတ်အပိုင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (PCA) ကွက်။ D. ပုံ ၂ တွင် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားသော အမျှင် ၁၀၀၀ မှ ဆုံးဖြတ်ထားသော PCA ကွက်ပေါ်တွင် nemaline myopathies နှင့် ထိန်းချုပ်လူနာများမှ အရိုးကြွက်သားအမျှင်များကို ပရိုဂျက်ထားသည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies နှင့် ထိန်းချုပ်လူနာများအကြား ကွာခြားချက်များကို နှိုင်းယှဉ်သည့် မီးတောင်ကွက်များ။ အရောင်စက်ဝိုင်းများသည် π < 0.05 တွင် သိသိသာသာကွဲပြားသော ပရိုတင်းများကို ညွှန်ပြပြီး မှောင်မိုက်သောအစက်များသည် FDR < 0.05 တွင် သိသိသာသာကွဲပြားသော ပရိုတင်းများကို ညွှန်ပြသည်။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို Limma linear model နည်းလမ်းနှင့် empirical Bayesian နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး Benjamini-Hochberg နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ နှိုင်းယှဉ်မှုများစွာအတွက် p-value ချိန်ညှိမှုဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ H. proteome တစ်ခုလုံးနှင့် အမျိုးအစား 1 နှင့် 2A အမျှင်များတွင် သိသိသာသာကွဲပြားစွာဖော်ပြသော ပရိုတင်းများ၏ ကြွယ်ဝမှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။ clusterProfiler package နှင့် Benjamini-Hochberg ချိန်ညှိထားသော p-value များကို အသုံးပြု၍ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ I, J. extracellular matrix နှင့် mitochondrial gene ontology (GO) term များဖြင့် အရောင်ခြယ်ထားသော Principal component analysis (PCA) plots။
nemaline myopathies များသည် ကြွက်သားများတွင် MYH-expressing myofiber အမျိုးအစားများ၏ အချိုးအစားကို လွှမ်းမိုးနိုင်သောကြောင့်၊19,20 ကျွန်ုပ်တို့သည် nemaline myopathies များနှင့် ထိန်းချုပ်ထားသော လူနာများတွင် MYH-expressing myofiber အမျိုးအစားများကို ဦးစွာစစ်ဆေးခဲ့ပါသည်။ 1000 myofiber assay အတွက် ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သော ဘက်လိုက်မှုမရှိသောနည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ myofiber အမျိုးအစားကို ကျွန်ုပ်တို့ဆုံးဖြတ်ခဲ့ပြီး သန့်စင်သော 2X myofibers များကို ထပ်မံဖော်ထုတ်ရန်ပျက်ကွက်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 6B)။ ACTA1 မျိုးရိုးဗီဇပြောင်းလဲမှုရှိသော လူနာနှစ်ဦးတွင် အမျိုးအစား 1 myofibers အချိုးအစားပိုများပြီး TNNT1 nemaline myopathy ရှိသော လူနာနှစ်ဦးတွင် အမျိုးအစား 1 myofibers အချိုးအစားလျော့နည်းသောကြောင့် nemaline myopathies ၏ myofiber အမျိုးအစားအပေါ် မတူညီသောအကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပါသည် (ပုံ 6B)။ အမှန်စင်စစ်၊ MYH2 နှင့် fast troponin isoforms (TNNC2၊ TNNI2 နှင့် TNNT3) တို့၏ expression သည် ACTA1-nemaline myopathies များတွင် လျော့နည်းသွားသော်လည်း MYH7 expression သည် TNNT1-nemaline myopathies များတွင် လျော့နည်းသွားသည် (Supplementary Figure 11A)။ ၎င်းသည် nemaline myopathies များတွင် heterogeneous myofiber type switching ၏ ယခင်အစီရင်ခံစာများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။19,20 ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤရလဒ်များကို immunohistochemistry ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့ပြီး ACTA1-nemaline myopathy ရှိသော လူနာများတွင် type 1 myofibers များ လွှမ်းမိုးနေပြီး TNNT1-nemaline myopathy ရှိသော လူနာများတွင် ဆန့်ကျင်ဘက်ပုံစံရှိကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (Figure 6A)။
single-fiber proteome အဆင့်တွင် ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathy လူနာများမှ skeletal muscle fibers များသည် control fibers အများစုနှင့် စုပြုံနေပြီး TNNT1 nemaline myopathy fibers များသည် အပြင်းထန်ဆုံး ထိခိုက်ခံရလေ့ရှိသည် (ပုံ 6C)။ ၎င်းသည် လူနာတစ်ဦးချင်းစီအတွက် pseudo-inflated fibers များ၏ principal component analysis (PCA) plots များကို plot လုပ်သည့်အခါ အထူးသဖြင့် ထင်ရှားပြီး TNNT1 nemaline myopathy လူနာ ၂ နှင့် ၃ တို့သည် control samples များနှင့် အဝေးဆုံးတွင် ရှိနေသည် (Supplementary Figure 11B၊ Supplementary Data Set 20)။ myopathy လူနာများမှ fibers များသည် ကျန်းမာသော fibers များနှင့် မည်သို့နှိုင်းယှဉ်သည်ကို ပိုမိုနားလည်ရန်အတွက် ကျန်းမာသော အရွယ်ရောက်ပြီးသူ ပါဝင်သူများထံမှ fibers ၁၀၀၀ ၏ proteomic analysis မှ ရရှိသော အသေးစိတ်အချက်အလက်များကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ myopathy dataset (ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathy လူနာများနှင့် controls) မှ fibers များကို 1000-fiber proteomic analysis မှ ရရှိသော PCA plot ပေါ်သို့ project လုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 6D)။ ထိန်းချုပ်အမျှင်များတွင် PC2 တလျှောက် MYH အမျှင်အမျိုးအစားများ ဖြန့်ဖြူးမှုသည် 1000-fiber proteomic analysis မှရရှိသော အမျှင်ဖြန့်ဖြူးမှုနှင့် ဆင်တူသည်။ သို့သော် nemaline myopathy လူနာများတွင် အမျှင်အများစုသည် ၎င်းတို့၏ မူရင်း MYH အမျှင်အမျိုးအစား မည်သို့ပင်ရှိစေကာမူ ကျန်းမာသော fast-twitch အမျှင်များနှင့် ထပ်တူကျကာ PC2 အောက်သို့ ရွေ့လျားသွားသည်။ ထို့ကြောင့် ACTA1 nemaline myopathy ရှိသော လူနာများသည် MYH-based နည်းလမ်းများကို အသုံးပြု၍ ပမာဏသတ်မှတ်သောအခါ အမျိုးအစား 1 အမျှင်များဆီသို့ ပြောင်းလဲမှုကို ပြသသော်လည်း ACTA1 nemaline myopathy နှင့် TNNT1 nemaline myopathy နှစ်ခုစလုံးသည် skeletal muscle fiber proteome ကို fast-twitch အမျှင်များဆီသို့ ရွေ့လျားစေခဲ့သည်။
ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျန်းမာသော ထိန်းချုပ်မှုအုပ်စုများနှင့် လူနာအုပ်စုတစ်ခုစီကို တိုက်ရိုက်နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပြီး ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies များတွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော ပရိုတင်း ၂၅၆ ခုနှင့် ၅၅၂ ခုကို အသီးသီး ဖော်ထုတ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ 6E–G နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 11C၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာအစုံ ၂၁)။ မျိုးရိုးဗီဇကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပရိုတင်းများတွင် ညှိနှိုင်းထားသော ကျဆင်းမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 6H–I၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာအစုံ ၂၂)။ အံ့သြစရာကောင်းတာက ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies များတွင် အမျှင်အမျိုးအစားများ ကွဲပြားစွာ လွှမ်းမိုးနေသော်လည်း ဤကျဆင်းမှုသည် MYH-အခြေခံ အမျှင်အမျိုးအစားနှင့် လုံးဝမသက်ဆိုင်ပါ (ပုံ 6H နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 11D–I၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာအစုံ ၂၃)။ အဏုဇီဝပရိုတင်းသုံးမျိုးကို ACTA1 သို့မဟုတ် TNNT1 nemaline myopathies တွင်လည်း ထိန်းညှိပေးခဲ့သည်။ ဤမိုက်ခရိုပရိုတင်းများထဲမှ နှစ်ခုဖြစ်သည့် ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 သို့မဟုတ် Lnc-FOXO1 ဟုလည်းလူသိများသည်) နှင့် ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) တို့သည် အမျိုးအစား 1 myofibers များတွင်သာ ကွဲပြားသော ပေါများမှုကို ပြသခဲ့သည်။ ENSG00000215483_TR14_ORF67 သည် ဆဲလ်သံသရာ ထိန်းညှိမှုတွင် အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း ယခင်က သတင်းပို့ထားပါသည်။ ၅၆ အခြားတစ်ဖက်တွင်၊ ကျန်းမာသော ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ACTA1-nemaline myopathy တွင် အမျိုးအစား 1 နှင့် အမျိုးအစား 2A myofibers နှစ်မျိုးလုံးတွင် မြင့်တက်လာခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 12A၊ နောက်ဆက်တွဲဒေတာအစုံ ၂၄)။ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနဲ့၊ ACTA1 nemaline myopathy မှာ RPS17 ကို downregulated လုပ်ထားပေမယ့် ribosomal ပရိုတင်းတွေဟာ nemaline myopathy ရဲ့ သက်ရောက်မှုကို အများအားဖြင့် မခံစားရပါဘူး (ပုံ 6E)။
ကြွယ်ဝမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအရ ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies များတွင် ကိုယ်ခံအားစနစ် လုပ်ငန်းစဉ်များ မြင့်တက်လာကြောင်း တွေ့ရှိရပြီး TNNT1 nemaline myopathy တွင်လည်း ဆဲလ်ကပ်ငြိမှု မြင့်တက်လာကြောင်း တွေ့ရှိရသည် (ပုံ 6H)။ ဤ extracellular factors များ၏ ကြွယ်ဝမှုကို PC1 နှင့် PC2 ရှိ PCA ကို အပျက်သဘောဆောင်သော ဦးတည်ချက် (ဆိုလိုသည်မှာ အထိခိုက်ဆုံး အမျှင်များဆီသို့) ပြောင်းလဲနေသော extracellular matrix ပရိုတိန်းများက ထင်ဟပ်စေသည် (ပုံ 6J)။ လူနာအုပ်စုနှစ်ခုစလုံးသည် annexins (ANXA1၊ ANXA2၊ ANXA5)57,58 နှင့် ၎င်းတို့၏ အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်သည့် ပရိုတိန်း S100A1159 (Supplementary Figures 12B–C) ကဲ့သို့သော ကိုယ်ခံအား တုံ့ပြန်မှုများနှင့် sarcolemmal ပြုပြင်ရေး ယန္တရားများတွင် ပါဝင်သော extracellular ပရိုတိန်းများ၏ ဖော်ပြမှု မြင့်တက်လာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဤလုပ်ငန်းစဉ်ကို muscular dystrophies60 တွင် မြှင့်တင်ပေးသည်ဟု ယခင်က သတင်းပို့ထားသော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့ သိရှိသလောက်၊ ယခင်က nemaline myopathies များနှင့် မဆက်စပ်ခဲ့ပါ။ ဤမော်လီကျူး ယန္တရား၏ ပုံမှန်လုပ်ဆောင်ချက်သည် ဒဏ်ရာရပြီးနောက် sarcolemmal ပြုပြင်ရန်နှင့် အသစ်ဖွဲ့စည်းထားသော myocytes များကို myofibers58,61 နှင့် ပေါင်းစပ်ရန်အတွက် လိုအပ်ပါသည်။ ထို့ကြောင့် လူနာအုပ်စုနှစ်စုစလုံးတွင် ဤလုပ်ငန်းစဉ်၏ လှုပ်ရှားမှုတိုးလာခြင်းသည် myofiber မတည်ငြိမ်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော ဒဏ်ရာအပေါ် ပြန်လည်ပြုပြင်မှုတုံ့ပြန်မှုကို အကြံပြုထားသည်။
nemaline myopathy တစ်ခုချင်းစီ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများသည် ကောင်းစွာ ဆက်စပ်မှုရှိကြောင်း (r = 0.736) နှင့် သင့်တင့်လျောက်ပတ်သော ထပ်တူကျမှုကို ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11A–B)၊ ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathy တို့သည် proteome အပေါ် အလားတူအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ သို့သော်၊ အချို့သောပရိုတိန်းများကို ACTA1 သို့မဟုတ် TNNT1 nemaline myopathy တွင်သာ ထိန်းညှိထားသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11A နှင့် C)။ profibrotic ပရိုတိန်း MFAP4 သည် TNNT1 nemaline myopathy တွင် အထိန်းညှိမှုအများဆုံးပရိုတိန်းများထဲမှ တစ်ခုဖြစ်သော်လည်း ACTA1 nemaline myopathy တွင် မပြောင်းလဲပါ။ HOX မျိုးဗီဇမှတ်တမ်းကို ထိန်းညှိပေးသည့် PAF1C complex ၏ အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်သည့် SKIC8 ကို TNNT1 nemaline myopathy တွင် လျှော့ချထားသော်လည်း ACTA1 nemaline myopathy တွင် သက်ရောက်မှုမရှိပါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 11A)။ ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathy ကို တိုက်ရိုက်နှိုင်းယှဉ်ကြည့်ခြင်းအားဖြင့် TNNT1 nemaline myopathy တွင် မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ပရိုတင်းများ လျော့နည်းသွားခြင်းနှင့် ကိုယ်ခံအားစနစ် ပရိုတင်းများ တိုးလာခြင်းတို့ကို တွေ့ရှိရသည် (ပုံ 6G–H နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 11C နှင့် 11H–I)။ ဤဒေတာများသည် TNNT1 nemaline myopathy နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက TNNT1 nemaline myopathy တွင် တွေ့ရှိရသော atrophy/dystrophy ပိုများခြင်းနှင့် ကိုက်ညီပါသည် (ပုံ 6A)၊ TNNT1 nemaline myopathy သည် ရောဂါ၏ ပိုမိုပြင်းထန်သောပုံစံကို ကိုယ်စားပြုကြောင်း အကြံပြုထားသည်။
nemaline myopathy ရဲ့ တွေ့ရှိရတဲ့ အကျိုးသက်ရောက်မှုတွေက ကြွက်သားအဆင့်တစ်ခုလုံးမှာ တည်ရှိနေခြင်း ရှိ၊ မရှိ အကဲဖြတ်ဖို့အတွက်၊ TNNT1 nemaline myopathy လူနာအုပ်စုတူကနေ ကြွက်သားတစ်သျှူးစစ်ဆေးမှုတွေရဲ့ bulk proteomic analysis ကို ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး controller တွေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါတယ် (အုပ်စုတစ်စုလျှင် n=3) (Supplementary Fig. 13A၊ Supplementary Data Set 25)။ မျှော်လင့်ထားတဲ့အတိုင်း controller တွေဟာ principal component analysis မှာ အနီးကပ်ဆက်စပ်နေပေမယ့် TNNT1 nemaline myopathy လူနာတွေကတော့ single fiber analysis မှာတွေ့ရတဲ့အတိုင်း intersample variability မြင့်မားတာကို ပြသခဲ့ပါတယ် (Supplementary Fig. 13B)။ Bulk analysis ဟာ differentially expressed proteins (Supplementary Fig. 13C၊ Supplementary Data Set 26) နဲ့ biological processes (Supplementary Fig. 13D၊ Supplementary Data Set 27) တွေကို တစ်ဦးချင်း fiber တွေကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်းအားဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြခဲ့ပေမယ့် fiber အမျိုးအစားတွေကို ခွဲခြားသိမြင်နိုင်စွမ်း ဆုံးရှုံးခဲ့ရပြီး fiber တွေတစ်လျှောက်မှာ heterogeneous disease effects တွေကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားဖို့ ပျက်ကွက်ခဲ့ပါတယ်။
ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ဤဒေတာများသည် single-myofiber proteomics များသည် immunoblotting ကဲ့သို့သော ပစ်မှတ်ထားနည်းလမ်းများဖြင့် မတွေ့ရှိနိုင်သော ဆေးခန်းဆိုင်ရာ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ လက္ခဏာများကို ရှင်းလင်းစွာဖော်ပြနိုင်ကြောင်း ပြသနေသည်။ ထို့အပြင်၊ ဤဒေတာများသည် phenotypic adaptation ကိုဖော်ပြရန် actin fiber typing (MYH) တစ်ခုတည်းအသုံးပြုခြင်း၏ ကန့်သတ်ချက်များကို မီးမောင်းထိုးပြသည်။ အမှန်စင်စစ်၊ fiber type switching သည် actin နှင့် troponin nemaline myopathies အကြား မတူညီသော်လည်း၊ nemaline myopathies နှစ်ခုစလုံးသည် MYH fiber typing မှ skeletal muscle fiber metabolism မှ ပိုမိုမြန်ဆန်ပြီး oxidative နည်းသော muscle proteome သို့ ခွဲထုတ်ထားသည်။
ဆဲလ်ကွဲပြားမှုသည် တစ်ရှူးများ၏ မတူကွဲပြားသော လိုအပ်ချက်များကို ဖြည့်ဆည်းရန် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ အရိုးစုကြွက်သားများတွင်၊ ၎င်းကို မကြာခဏ အားထုတ်လုပ်မှုနှင့် မောပန်းလွယ်မှုအဆင့် အမျိုးမျိုးဖြင့် လက္ခဏာရပ်ပြသော အမျှင်အမျိုးအစားများအဖြစ် ဖော်ပြလေ့ရှိသည်။ သို့သော်၊ ၎င်းသည် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင် ကွဲပြားမှု၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်ကိုသာ ရှင်းပြကြောင်း ထင်ရှားပြီး ယခင်က ထင်ထားသည်ထက် များစွာ ပိုမိုကွဲပြား၊ ရှုပ်ထွေးပြီး မျက်နှာစာများစွာရှိသည်။ နည်းပညာတိုးတက်မှုများသည် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များကို ထိန်းညှိပေးသည့် အချက်များကို ယခုအခါ အလင်းပြပေးခဲ့သည်။ အမှန်စင်စစ်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ အချက်အလက်များက အမျိုးအစား 2X အမျှင်များသည် ထူးခြားသော အရိုးစုကြွက်သားအမျှင် မျိုးကွဲတစ်ခု မဟုတ်နိုင်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ထို့အပြင်၊ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင် ကွဲပြားမှု၏ အဓိကအဆုံးအဖြတ်ပေးသည့်အရာများအဖြစ် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ပရိုတိန်းများ၊ ရိုင်ဘိုဇိုမယ် ပရိုတိန်းများနှင့် ဆဲလ်နှင့်ဆက်စပ်သော ပရိုတိန်းများကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်ခဲ့သည်။ နီမာတုတ်ကြွက်သားရောဂါရှိသော လူနာနမူနာများတွင် ကျွန်ုပ်တို့၏ ပရိုတီယိုမစ်လုပ်ငန်းစဉ်ကို အသုံးချခြင်းဖြင့်၊ MYH-based fiber typing သည် အရိုးစုကြွက်သား ကွဲပြားမှုကို အပြည့်အဝ ထင်ဟပ်ခြင်းမရှိကြောင်း၊ အထူးသဖြင့် စနစ်အနှောင့်အယှက်ဖြစ်သည့်အခါတွင် အပြည့်အဝ ထင်ဟပ်ခြင်းမရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ထပ်မံပြသခဲ့သည်။ အမှန်စင်စစ်၊ MYH-based fiber အမျိုးအစား မည်သို့ပင်ရှိစေကာမူ နီမာတုတ်ကြွက်သားရောဂါသည် ပိုမိုမြန်ဆန်ပြီး အောက်ဆီဒေးရှင်းနည်းသော အမျှင်များဆီသို့ ပြောင်းလဲသွားစေပါသည်။
၁၉ ရာစုကတည်းက အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များကို အမျိုးအစားခွဲခြားခဲ့သည်။ မကြာသေးမီက omics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများသည် မတူညီသော MYH အမျှင်အမျိုးအစားများ၏ ဖော်ပြချက်ပရိုဖိုင်များနှင့် မတူညီသော လှုံ့ဆော်မှုများအပေါ် ၎င်းတို့၏ တုံ့ပြန်မှုများကို နားလည်ရန် စတင်ခွင့်ပြုခဲ့သည်။ ဤနေရာတွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ omics ချဉ်းကပ်မှုများသည် အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်အမျိုးအစားကို သတ်မှတ်ရန် တစ်ခုတည်းသော (သို့မဟုတ် အနည်းငယ်) အမှတ်အသားများ၏ ပမာဏကို အားကိုးခြင်းမရှိဘဲ ရိုးရာ antibody-based နည်းလမ်းများထက် အမျှင်အမျိုးအစား အမှတ်အသားများကို ပမာဏသတ်မှတ်ရာတွင် ပိုမိုအာရုံခံနိုင်စွမ်း၏ အားသာချက်လည်းရှိသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဖြည့်စွက် transcriptomic နှင့် proteomic workflows များကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များတွင် အမျှင်ကွဲပြားမှု၏ transcriptional နှင့် post-transcriptional ထိန်းညှိမှုကို စစ်ဆေးရန် ရလဒ်များကို ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ ဤ workflow သည် ကျန်းမာသော လူငယ်များ၏ vastus lateralis တွင် ပရိုတိန်းအဆင့်တွင် သန့်စင်သော 2X-type အမျှင်များကို ဖော်ထုတ်ရန် ပျက်ကွက်စေခဲ့သည်။ ၎င်းသည် ကျန်းမာသော vastus lateralis တွင် <1% သန့်စင်သော 2X အမျှင်များကို တွေ့ရှိခဲ့သည့် ယခင် single fiber လေ့လာမှုများနှင့် ကိုက်ညီသော်လည်း အနာဂတ်တွင် အခြားကြွက်သားများတွင် အတည်ပြုသင့်သည်။ mRNA အဆင့်တွင် နီးပါးသန့်စင်သော 2X အမျှင်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် ပရိုတိန်းအဆင့်တွင် ရောနှောထားသော 2A/2X အမျှင်များသာ ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းကြား ကွဲလွဲမှုသည် ပဟေဠိဆန်သည်။ MYH isoform mRNA ဖော်ပြမှုသည် circadian မဟုတ်ပါ၊67 ၎င်းသည် RNA အဆင့်တွင် သန့်စင်သော 2X အမျှင်များတွင် MYH2 စတင်ခြင်းအချက်ပြမှုကို "လွတ်သွား" ရန် မဖြစ်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ရှင်းလင်းချက်တစ်ခုမှာ ရိုးရှင်းစွာ ယူဆချက်ဖြစ်သော်လည်း MYH isoform များအကြား ပရိုတင်းနှင့်/သို့မဟုတ် mRNA တည်ငြိမ်မှုတွင် ကွဲပြားမှုများ ဖြစ်နိုင်သည်။ အမှန်စင်စစ်၊ မည်သည့် MYH isoform အတွက်မျှ fast fiber သည် 100% သန့်စင်ခြင်းမရှိပါ၊ ထို့အပြင် 70–90% အတိုင်းအတာရှိ MYH1 mRNA ဖော်ပြမှုအဆင့်များသည် ပရိုတင်းအဆင့်တွင် တူညီသော MYH1 နှင့် MYH2 ပေါများမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေမည်လားဆိုသည်ကို မရှင်းလင်းပါ။ သို့သော် transcriptome သို့မဟုတ် proteome တစ်ခုလုံးကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသောအခါ၊ cluster analysis သည် ၎င်းတို့၏ တိကျသော MYH ဖွဲ့စည်းမှု မည်သို့ပင်ရှိစေကာမူ နှေးကွေးသောနှင့် မြန်ဆန်သော skeletal muscle fiber များကို ကိုယ်စားပြုသည့် ကွဲပြားသော cluster နှစ်ခုကိုသာ ယုံကြည်စိတ်ချစွာ ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည်။ ၎င်းသည် myonuclear cluster နှစ်ခုကိုသာ ခွဲခြားသတ်မှတ်လေ့ရှိသော single-nucleus transcriptomic ချဉ်းကပ်မှုများကို အသုံးပြုသည့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ ၆၈၊ ၆၉၊ ၇၀ ထို့အပြင်၊ ယခင်ပရိုတီယိုမစ်လေ့လာမှုများသည် အမျိုးအစား 2X အမျှင်များကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သော်လည်း၊ ဤအမျှင်များသည် ကျန်မြန်ဆန်သောအမျှင်များနှင့် သီးခြားစီစုပုံခြင်းမရှိဘဲ MYH ကိုအခြေခံ၍ အခြားအမျှင်အမျိုးအစားများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကွဲပြားစွာပေါများသော ပရိုတိန်းအနည်းငယ်ကိုသာ ပြသသည်။ ၁၄ ဤရလဒ်များက လူ့အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်များကို MYH ကိုအခြေခံ၍ ကွဲပြားသောအတန်းအစားသုံးမျိုးအဖြစ်မဟုတ်ဘဲ ၎င်းတို့၏ဇီဝဖြစ်စဉ်နှင့် ကျုံ့နိုင်သောဂုဏ်သတ္တိများအပေါ်အခြေခံ၍ အစုအဝေးနှစ်ခုအဖြစ် ပိုင်းခြားသည့် ကြွက်သားအမျှင်ခွဲခြားမှု၏ ၂၀ ရာစုအစောပိုင်းအမြင်သို့ ပြန်သွားသင့်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ၆၃
ပိုအရေးကြီးတာက myofiber ကွဲပြားမှုကို ဘက်ပေါင်းစုံကနေ ထည့်သွင်းစဉ်းစားသင့်ပါတယ်။ ယခင် “omics” လေ့လာမှုတွေက ဒီဦးတည်ချက်ကို ညွှန်ပြနေပြီး အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်တွေဟာ သီးခြားအစုအဝေးတွေ မဖွဲ့စည်းဘဲ စဉ်ဆက်မပြတ် တည်ရှိနေတယ်လို့ အကြံပြုထားပါတယ်။ ၁၁၊ ၁၃၊ ၁၄၊ ၆၄၊ ၇၁ ဒီမှာ အရိုးစုကြွက်သားရဲ့ ကျုံ့နိုင်စွမ်းနဲ့ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိတွေ ကွာခြားချက်တွေအပြင် myofibers တွေကို ဆဲလ်-ဆဲလ် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုတွေနဲ့ ဘာသာပြန်ယန္တရားတွေနဲ့ ဆက်စပ်နေတဲ့ အင်္ဂါရပ်တွေနဲ့ ခွဲခြားသိရှိနိုင်တယ်ဆိုတာ ကျွန်ုပ်တို့ ပြသထားပါတယ်။ အမှန်စင်စစ်၊ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်တွေမှာ ရိုင်ဗိုဆုမ်း ကွဲပြားမှုဟာ နှေးကွေးပြီး မြန်ဆန်တဲ့ အမျှင်အမျိုးအစားတွေပေါ် မူတည်ပြီး ကွဲပြားမှုကို ပံ့ပိုးပေးတာကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ်။ နှေးကွေးပြီး မြန်ဆန်တဲ့ အမျှင်အမျိုးအစားပေါ် မူတည်ပြီး ဒီများပြားလှတဲ့ myofiber ကွဲပြားမှုရဲ့ အခြေခံအကြောင်းရင်းက မရှင်းလင်းသေးပေမယ့် သတ်မှတ်ထားတဲ့ စွမ်းအားတွေနဲ့ ဝန်တွေကို အကောင်းဆုံး တုံ့ပြန်တဲ့ ကြွက်သားအစုအဝေးတွေအတွင်း အထူးပြု နေရာချထားမှု၊ ကြွက်သားအဏုဇီဝပတ်ဝန်းကျင်မှာ အခြားဆဲလ်အမျိုးအစားတွေနဲ့ အထူးပြု ဆဲလ် ဒါမှမဟုတ် ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါ ဆက်သွယ်မှု ၇၃,၇၄,၇၅ ဒါမှမဟုတ် တစ်ဦးချင်း myofibers အတွင်း ရိုင်ဗိုဆုမ်း လှုပ်ရှားမှု ကွာခြားချက်တွေကို ညွှန်ပြနိုင်ပါတယ်။ အမှန်စင်စစ်၊ RPL3 နှင့် RPL3L ၏ paralogous အစားထိုးခြင်းမှတစ်ဆင့် သို့မဟုတ် rRNA ၏ 2′O-methylation အဆင့်တွင် ရိုင်ဘိုဆိုမ် heteroplasmy သည် skeletal muscle hypertrophy76,77 နှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသထားသည်။ Multi-omic နှင့် spatial applications များသည် တစ်ဦးချင်း myofibers များ၏ functional characterization နှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် multi-omic အဆင့်78 တွင် ကြွက်သားဇီဝဗေဒအကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ နားလည်မှုကို ပိုမိုတိုးတက်စေမည်ဖြစ်သည်။
nemaline myopathies ရှိသောလူနာများထံမှ single myofibers များ၏ proteomes များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းဖြင့်၊ ကြွက်သားများ၏ လက်တွေ့ရောဂါဗေဒကို ရှင်းလင်းစေရန် single myofiber proteomics များ၏ အသုံးဝင်မှု၊ ထိရောက်မှုနှင့် အသုံးချနိုင်မှုကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြခဲ့ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ workflow ကို global proteomic analysis နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် single myofiber proteomics များသည် global tissue proteomics များနှင့် တူညီသော သတင်းအချက်အလက်များ၏ အနက်ကို ပေးစွမ်းပြီး interfiber heterogeneity နှင့် myofiber type ကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခြင်းဖြင့် ဤအနက်ကို တိုးချဲ့ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ သရုပ်ပြနိုင်ခဲ့ပါသည်။ ကျန်းမာသော ထိန်းချုပ်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies များတွင် တွေ့ရှိရသော fiber type ratio တွင် မျှော်လင့်ထားသည့် (ပြောင်းလဲနိုင်သော်လည်း) ကွာခြားချက်များအပြင်၊19 MYH-mediated fiber type switching မှ မသက်ဆိုင်သော oxidative နှင့် extracellular remodeling ကိုလည်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။ TNNT1 nemaline myopathies များတွင် Fibrosis ကို ယခင်က ဖော်ပြထားပါသည်။၁၉ သို့သော် ကျွန်ုပ်တို့၏ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ဤတွေ့ရှိချက်ကို အခြေခံ၍ ACTA1 နှင့် TNNT1 nemaline myopathies ရှိသော လူနာများမှ myofibers များတွင် sarcolemmal ပြုပြင်မှု ယန္တရားများတွင် ပါဝင်သော annexins ကဲ့သို့သော extracellular ထုတ်လွှတ်သော stress-related proteins ပမာဏ မြင့်တက်လာမှုကို ဖော်ထုတ်ပြသခြင်းဖြင့် တည်ဆောက်ထားပါသည်။၅၇,၅၈,၅၉ အဆုံးသတ်အနေဖြင့် nemaline myopathy ရှိသော လူနာများမှ myofibers များတွင် annexin ပမာဏ မြင့်တက်လာခြင်းသည် ပြင်းထန်စွာ atrophic myofibers များကို ပြုပြင်ရန် ဆဲလ်တုံ့ပြန်မှုကို ကိုယ်စားပြုနိုင်ပါသည်။
ဤလေ့လာမှုသည် ယနေ့အထိ လူသားများ၏ အကြီးမားဆုံးသော single-fiber whole-muscle-omics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ကိုယ်စားပြုသော်လည်း၊ ၎င်းသည် ကန့်သတ်ချက်များ မရှိပါ။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကြွက်သားအမျှင်များကို ပါဝင်သူများ၏ နှိုင်းယှဉ်ရလွယ်ကူပြီး တစ်သားတည်းဖြစ်သော နမူနာတစ်ခုနှင့် တစ်ခုတည်းသော ကြွက်သား (vastus lateralis) မှ ခွဲထုတ်ခဲ့ပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကြွက်သားအမျိုးအစားများနှင့် ကြွက်သားဇီဝကမ္မဗေဒ၏ အစွန်းအဖျားများတွင် သီးခြားအမျှင်လူဦးရေများ ရှိနေခြင်းကို ဖယ်ထုတ်ရန် မဖြစ်နိုင်ပါ။ ဥပမာအားဖြင့်၊ အလွန်မြန်ဆန်သော အမျှင်များ (ဥပမာ၊ သန့်စင်သော 2X အမျှင်များ) သည် အဆင့်မြင့်လေ့ကျင့်ထားသော အပြေးသမားများနှင့်/သို့မဟုတ် ခွန်အားကစားသမားများတွင် သို့မဟုတ် ကြွက်သားလှုပ်ရှားမှုမရှိသောကာလများတွင် ပေါ်ပေါက်လာနိုင်ခြေကို ကျွန်ုပ်တို့ ဖယ်ထုတ်၍မရပါ66,80။ ထို့အပြင်၊ ပါဝင်သူများ၏ နမူနာအရွယ်အစား အကန့်အသတ်ရှိခြင်းကြောင့် အမျှင်အမျိုးအစား အချိုးအစားများသည် အမျိုးသားနှင့် အမျိုးသမီးများကြားတွင် ကွဲပြားကြောင်း သိရှိထားသောကြောင့် အမျှင်ကွဲပြားမှုတွင် လိင်ကွဲပြားမှုများကို စုံစမ်းစစ်ဆေးခြင်းမှ ကျွန်ုပ်တို့အား တားဆီးထားပါသည်။ ထို့အပြင်၊ တူညီသော ကြွက်သားအမျှင်များ သို့မဟုတ် တူညီသော ပါဝင်သူများထံမှ နမူနာများတွင် transcriptomic နှင့် proteomic ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ကျွန်ုပ်တို့ မပြုလုပ်နိုင်ခဲ့ပါ။ ကျွန်ုပ်တို့နှင့် အခြားသူများသည် အလွန်နည်းသော နမူနာထည့်သွင်းမှု (မိုက်တိုခွန်ဒရီးယား ကြွက်သားရောဂါရှိသော လူနာများထံမှ အမျှင်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရာတွင် ပြသထားသည့်အတိုင်း) ရရှိရန် omics ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အသုံးပြု၍ single-cell နှင့် single-myofiber ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ဆက်လက်အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင် လုပ်ဆောင်နေသည်နှင့်အမျှ၊ single muscle fibers များအတွင်း multi-omics (နှင့် functional) ချဉ်းကပ်မှုများကို ပေါင်းစပ်ရန် အခွင့်အလမ်းသည် ထင်ရှားလာပါသည်။
အလုံးစုံသော်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် အရိုးစုကြွက်သားများ ကွဲပြားမှု၏ စာသားရေးသားခြင်းနှင့် ရေးသားပြီးနောက် မောင်းနှင်အားများကို ဖော်ထုတ်ရှင်းပြပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ အရိုးစုကြွက်သားဇီဝကမ္မဗေဒတွင် ရှည်လျားစွာတည်ရှိနေသော အယူဝါဒကို စိန်ခေါ်သည့်ဒေတာကို ကျွန်ုပ်တို့တင်ပြပါသည်။ အရိုးစုကြွက်သားအမျှင်ခွဲခြားခြင်းနှင့် ကွဲပြားမှုအပေါ် ကျွန်ုပ်တို့၏နားလည်မှုကို ပြန်လည်စဉ်းစားပြီး နောက်ဆုံးတွင် အငြင်းပွားမှုကို ပြန်လည်ဆန်းသစ်ရန် မျှော်လင့်ပါသည်။
လူဖြူပါဝင်သူ ၁၄ ဦး (အမျိုးသား ၁၂ ဦးနှင့် အမျိုးသမီး ၂ ဦး) သည် ဤလေ့လာမှုတွင် ပါဝင်ရန် စေတနာ့ဝန်ထမ်း သဘောတူညီခဲ့ကြသည်။ ဤလေ့လာမှုကို Ghent တက္ကသိုလ်ဆေးရုံ၏ ကျင့်ဝတ်ကော်မတီ (BC-10237) မှ အတည်ပြုခဲ့ပြီး ၂၀၁၃ ခုနှစ် Helsinki ကြေငြာချက်ကို လိုက်နာခဲ့ပြီး ClinicalTrials.gov (NCT05131555) တွင် မှတ်ပုံတင်ခဲ့သည်။ ပါဝင်သူများ၏ အထွေထွေဝိသေသလက္ခဏာများကို နောက်ဆက်တွဲဇယား ၁ တွင် ဖော်ပြထားသည်။ နှုတ်ဖြင့်နှင့် ရေးသားထားသော သတင်းအချက်အလက်အပြည့်အစုံပါသော သဘောတူညီချက်ရရှိပြီးနောက်၊ ပါဝင်သူများသည် လေ့လာမှုတွင် နောက်ဆုံးပါဝင်ခြင်းမပြုမီ ဆေးစစ်မှုခံယူခဲ့ကြသည်။ ပါဝင်သူများသည် အသက်ငယ်ရွယ်သူများ (အသက် ၂၂-၄၂ နှစ်)၊ ကျန်းမာသူများ (ဆေးဘက်ဆိုင်ရာအခြေအနေမရှိ၊ ဆေးလိပ်သောက်ခြင်းမှတ်တမ်းမရှိ) နှင့် အသင့်အတင့် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ တက်ကြွသူများဖြစ်သည်။ ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာကြံ့ခိုင်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက် အမြင့်ဆုံးအောက်ဆီဂျင်စုပ်ယူမှုကို step ergometer ကို အသုံးပြု၍ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ 81
ကြွက်သားတစ်သျှူးနမူနာများကို အနားယူချိန်နှင့် အစာရှောင်ချိန် ၁၄ ရက်ခြား၍ သုံးကြိမ်စုဆောင်းခဲ့သည်။ ဤနမူနာများကို ပိုမိုကြီးမားသော လေ့လာမှုတစ်ခု၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းအဖြစ် စုဆောင်းခဲ့သောကြောင့် ပါဝင်သူများသည် တစ်သျှူးစစ်ဆေးမှုမပြုလုပ်မီ ၄၀ မိနစ်အလိုတွင် placebo (lactose)၊ H1-receptor antagonist (fexofenadine ၅၄၀ မီလီဂရမ်) သို့မဟုတ် H2-receptor antagonist (famotidine ၄၀ မီလီဂရမ်) ကို သောက်သုံးခဲ့ကြသည်။ ဤ histamine receptor antagonist များသည် အနားယူနေသော အရိုးစုကြွက်သားကြံ့ခိုင်မှုကို မထိခိုက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ယခင်က သရုပ်ပြခဲ့ပြီးဖြစ်ပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏ အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုကွက်များတွင် အခြေအနေနှင့်ဆက်စပ်သော clustering ကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (Supplementary Figures ၃ နှင့် ၆)။ စမ်းသပ်မှုနေ့တိုင်းမတိုင်မီ ၄၈ နာရီအလိုတွင် စံသတ်မှတ်ထားသော အစားအစာ (ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် ၄၁.၄ kcal/kg၊ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ် ၅.၁ ဂရမ်၊ ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် ပရိုတင်း ၁.၄ ဂရမ်/kg နှင့် ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် အဆီ ၁.၆ ဂရမ်/kg) ကို ထိန်းသိမ်းထားပြီး စမ်းသပ်မှုနေ့၏ မနက်ပိုင်းတွင် စံသတ်မှတ်ထားသော မနက်စာ (ခန္ဓာကိုယ်အလေးချိန် ကာဗိုဟိုက်ဒရိတ် ၁.၅ ဂရမ်/kg) ကို စားသုံးခဲ့သည်။ ထုံဆေးဖြင့် (epinephrine မပါသော 0.5 ml 1% lidocaine)၊ vastus lateralis ကြွက်သားမှ percutaneous Bergström aspiration ကို အသုံးပြု၍ ကြွက်သား biopsy များ ရယူခဲ့သည်။82 ကြွက်သားနမူနာများကို RNAlater တွင် ချက်ချင်းထည့်သွင်းပြီး လက်ဖြင့် fiber ခွဲစိတ်မှုမပြုလုပ်မချင်း (၃ ရက်အထိ) ၄°C တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။
အသစ်ခွဲထုတ်ထားသော myofiber အထုပ်များကို culture dish ထဲက RNAlater medium ထဲကို လွှဲပြောင်းလိုက်ပါတယ်။ ထို့နောက် stereomicroscope နှင့် fine tweezers များကို အသုံးပြု၍ တစ်ဦးချင်း myofibers များကို လက်ဖြင့် ခွဲစိတ်ခဲ့ပါတယ်။ biopsy ရဲ့ နေရာအမျိုးမျိုးက fiber တွေကို ရွေးချယ်ရာမှာ အထူးဂရုပြုပြီး biopsy တစ်ခုစီမှ fiber ၂၅ ချောင်းကို ခွဲစိတ်ခဲ့ပါတယ်။ ခွဲစိတ်ပြီးနောက် fiber တစ်ခုစီကို proteinase K နှင့် DNase enzymes များပါဝင်သော lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) 3 μl ထဲတွင် ညင်သာစွာနှစ်ပြီး မလိုလားအပ်သော protein များနှင့် DNA များကို ဖယ်ရှားခဲ့ပါတယ်။ ထို့နောက် Cell lysis နှင့် protein/DNA ဖယ်ရှားခြင်းကို vortexing ခဏတာ၊ microcentrifuge တွင် အရည်ကို လှည့်ခြင်းနှင့် အခန်းအပူချိန် (10 မိနစ်) တွင် incubation ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် စတင်ခဲ့ပါတယ်။ ထို့နောက် lysate ကို thermal cycler (T100, Bio-Rad) တွင် 37°C တွင် 5 မိနစ်၊ 75°C တွင် 5 မိနစ် incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက် နောက်ထပ် လုပ်ငန်းစဉ်မပြုလုပ်မချင်း -80°C တွင် ချက်ချင်းသိမ်းဆည်းခဲ့ပါတယ်။
Illumina-compatible polyadenylated RNA libraries များကို QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) ကို အသုံးပြု၍ myofiber lysate 2 µl မှ ပြင်ဆင်ထားပါသည်။ အသေးစိတ်နည်းလမ်းများကို ထုတ်လုပ်သူ၏ လက်စွဲတွင် ရှာဖွေနိုင်ပါသည်။ လုပ်ငန်းစဉ်သည် reverse transcription ဖြင့် first-strand cDNA ပေါင်းစပ်မှုဖြင့် စတင်ပြီး၊ ၎င်းတွင် နမူနာများ စုစည်းခြင်းကို သေချာစေပြီး downstream processing အတွင်း နည်းပညာဆိုင်ရာ ပြောင်းလဲမှုများကို လျှော့ချရန် unique molecular identifiers (UMIs) နှင့် sample-specific i1 barcodes များကို ထည့်သွင်းထားပါသည်။ ထို့နောက် myofibers ၉၆ ခုမှ cDNA ကို magnetic beads များဖြင့် စုစည်းပြီး သန့်စင်ပြီးနောက် RNA ကို ဖယ်ရှားပြီး second-strand ပေါင်းစပ်မှုကို random primers များကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ပါသည်။ library ကို magnetic beads များဖြင့် သန့်စင်ပြီး၊ pool-specific i5/i7 tags များကို ထည့်သွင်းကာ PCR ကို ချဲ့ထွင်ပါသည်။ နောက်ဆုံး သန့်စင်မှုအဆင့်သည် Illumina-compatible libraries များကို ထုတ်လုပ်ပေးပါသည်။ library pool တစ်ခုစီ၏ အရည်အသွေးကို High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့ပါသည်။
Qubit ပမာဏအပေါ်အခြေခံ၍ အစုအဝေးများကို equimolar செறிவுများ (2 nM) တွင် ထပ်မံစုစည်းခဲ့သည်။ ထို့နောက် ရရှိလာသော အစုအဝေးကို NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 နျူကလီယိုတိုက်များ) ကို 2 nM တင်ခြင်း (4% PhiX) ဖြင့် အသုံးပြု၍ စံမုဒ်တွင် NovaSeq 6000 တူရိယာပေါ်တွင် စီစစ်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ pipeline သည် Lexogen ၏ QuantSeq Pool data analysis pipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) ကို အခြေခံထားသည်။ i7/i5 index ကို အခြေခံ၍ bcl2fastq2 (v2.20.0) ဖြင့် data ကို ဦးစွာ demultiplexed လုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် Read 2 ကို i1 sample barcode ကို အခြေခံ၍ idemux (v0.1.6) ဖြင့် demultiplexed လုပ်ခဲ့ပြီး UMI sequences များကို umi_tools (v1.0.1) ဖြင့် ထုတ်ယူခဲ့သည်။ ထို့နောက် reads များကို cutadapt (v3.4) ဖြင့် round များစွာဖြင့် trim လုပ်ခဲ့ပြီး short reads (<20 in length) သို့မဟုတ် adapter sequences များသာပါဝင်သော reads များကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထို့နောက် reads များကို STAR (v2.6.0c) ကို အသုံးပြု၍ human genome နှင့် alignment လုပ်ခဲ့ပြီး BAM ဖိုင်များကို SAMtools (v1.11) ဖြင့် index လုပ်ခဲ့သည်။ Duplicate reads များကို umi_tools (v1.0.1) ကို အသုံးပြု၍ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင် Subread (v2.0.3) ရှိ featureCounts ကို အသုံးပြု၍ alignment counting ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှုကို ပိုက်လိုင်း၏ အလယ်အလတ်အဆင့်များစွာတွင် FastQC (v0.11.9) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
နောက်ထပ် ဇီဝသတင်းအချက်အလက်ဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်မှုနှင့် မြင်ယောင်မှုအားလုံးကို R (v4.2.3) တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး အဓိကအားဖြင့် Seurat (v4.4.0) workflow ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ 83 ထို့ကြောင့်၊ တစ်ဦးချင်း UMI တန်ဖိုးများနှင့် metadata matrices များကို Seurat objects များအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ အမျှင်အားလုံး၏ 30% အောက်တွင် ဖော်ပြထားသော မျိုးဗီဇများကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ အရည်အသွေးနိမ့် နမူနာများကို အနည်းဆုံး UMI တန်ဖိုး 1000 နှင့် တွေ့ရှိထားသော မျိုးဗီဇ 1000 အပေါ် အခြေခံ၍ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ အမျှင် 925 ခုသည် အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု filtering အဆင့်အားလုံးကို အောင်မြင်ခဲ့သည်။ UMI တန်ဖိုးများကို Seurat SCTransform v2 နည်းလမ်းကို အသုံးပြု၍ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ 84 ခုကို ထောက်လှမ်းထားသော အင်္ဂါရပ် 7418 ခုအားလုံး အပါအဝင်၊ ပါဝင်သူများအကြား ကွာခြားချက်များကို ပြန်လည်လျှော့ချခဲ့သည်။ သက်ဆိုင်ရာ metadata အားလုံးကို Supplementary Dataset 28 တွင် တွေ့ရှိနိုင်သည်။